310 10*1mm స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాయిల్డ్ ట్యూబ్ కెమికల్ కాంపోనెంట్, స్పిడ్రోయిన్ యొక్క N-టెర్మినల్ డొమైన్‌లు అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ ఆధారంగా హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయి మరియు ప్రోటీన్ స్థిరీకరణకు వేదికను అందిస్తాయి.

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు పరిమిత CSS మద్దతుతో బ్రౌజర్ సంస్కరణను ఉపయోగిస్తున్నారు.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతాము.
స్లైడర్‌లు ఒక్కో స్లయిడ్‌కు మూడు కథనాలను చూపుతున్నాయి.స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి వెనుక మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ప్రతి స్లయిడ్ ద్వారా తరలించడానికి చివర ఉన్న స్లయిడ్ కంట్రోలర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.

స్పెసిఫికేషన్

310 10*1mm స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాయిల్డ్ గొట్టాల సరఫరాదారులు

రసాయన కూర్పు

యాంత్రిక లక్షణాలు

రీకాంబినెంట్ స్పైడర్ సిల్క్ ప్రొటీన్లు (స్పైడర్ సిల్క్ ప్రొటీన్లు) కొత్త బయోమెటీరియల్స్ అభివృద్ధిలో అనేక సంభావ్య అనువర్తనాలను కలిగి ఉన్నాయి, అయితే వాటి మల్టీమోడల్ మరియు అగ్రిగేషన్-ప్రోన్ స్వభావం వాటిని పొందడం కష్టతరం చేస్తుంది మరియు ఉపయోగించడం సులభం చేస్తుంది.రీకాంబినెంట్ మినియేచర్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌లు మరియు ముఖ్యంగా, N-టెర్మినల్ డొమైన్ (NT) 37 °C వద్ద స్వీయ-సహాయక మరియు పారదర్శక హైడ్రోజెల్‌లను వేగంగా ఏర్పరుస్తుందని ఇక్కడ మేము నివేదిస్తాము.NT మరియు గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ లేదా ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్‌తో కూడిన ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లు పూర్తిగా పనిచేసే ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లను ఏర్పరుస్తాయి.హైడ్రోజెల్స్.మా ఫలితాలు రీకాంబినెంట్ NT మరియు ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లు అధిక వ్యక్తీకరణ దిగుబడిని అందజేస్తాయని మరియు పారదర్శకత, క్రాస్‌లింక్ లేకుండా జిలేషన్ మరియు అధిక సాంద్రత వద్ద క్రియాశీల ప్రోటీన్‌లను ప్రత్యక్షంగా స్థిరీకరించడం వంటి ఆకర్షణీయమైన లక్షణాలతో హైడ్రోజెల్‌లను అందజేస్తాయని చూపిస్తుంది.
సాలెపురుగులు ఏడు వేర్వేరు పట్టు గ్రంధులను కలిగి ఉంటాయి, ప్రతి ఒక్కటి నిర్దిష్ట రకం పట్టును ఉత్పత్తి చేస్తాయి.మొత్తం ఏడు పట్టు జాతులు స్పైడర్ సిల్క్ ప్రొటీన్‌లతో (స్పిడ్రోయిన్‌లు) సుమారు 6000 అవశేషాలు ఉంటాయి మరియు గోళాకార N- మరియు C-టెర్మినల్ డొమైన్‌లతో (NT మరియు CT) 1,2 చుట్టూ పెద్ద కేంద్ర పునరావృత ప్రాంతాన్ని కలిగి ఉంటాయి.అత్యంత విస్తృతంగా అధ్యయనం చేయబడిన పట్టు రకం, ప్రైమరీ ఆంపుల్లా, ప్రాథమిక అంపుల్ గ్రంధి ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది.ఈ గ్రంథిలో, ఎపిథీలియల్ కణాల మోనోలేయర్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌లను సంశ్లేషణ చేస్తుంది మరియు వాటిని గ్రంధి యొక్క ల్యూమన్‌లోకి స్రవిస్తుంది, ఇక్కడ అవి చాలా ఎక్కువ సాంద్రతలలో (30-50% w/v) 3,4 వద్ద కరిగే రూపంలో (డోపింగ్) ఉంటాయి.గ్రంధిలోని ప్రధాన ఆంపుల్లర్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క సంస్థ మరియు ఆకృతి చర్చనీయాంశమైంది, అయితే చాలా ప్రయోగాత్మక ఆధారాలు సాధారణంగా హెలికల్ మరియు/లేదా యాదృచ్ఛిక హెలికల్ కన్ఫర్మేషన్ మరియు మైకెల్లార్ లేదా లామెల్లార్ స్ట్రక్చర్‌ల ఉనికిని సూచిస్తున్నాయి.పునరావృత డొమైన్‌లు సిల్క్ ఫైబర్‌ల యొక్క యాంత్రిక లక్షణాలను నియంత్రిస్తాయి, β-షీట్ నానోక్రిస్టల్స్ మరియు నిరాకార నిర్మాణాలను ఏర్పరుస్తాయి 11,12,13,14,15, ఎండ్ డొమైన్‌లు సిల్క్ గ్రంధి వెంట మారుతున్న పరిస్థితులకు ప్రతిస్పందనగా సిల్క్ ఫైబర్‌లను నియంత్రిస్తాయి.పట్టు నిర్మాణాన్ని నియంత్రించడం ద్వారా, 19. టెర్మినల్ డొమైన్‌లు పరిణామాత్మకంగా సంరక్షించబడతాయి మరియు వాటి పనితీరు 2,20,21 అన్ని స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌లకు సాధారణం కావచ్చు.గ్రంధి గుండా వెళ్ళే సమయంలో, స్పిడ్రోయిన్ యొక్క pH సుమారు 7.6 నుండి <5.716కి తగ్గుతుంది మరియు క్రమంగా ఇరుకైన వాహిక ద్వారా కదలిక ద్వారా మధ్యవర్తిత్వంతో కోత మరియు సాగతీతతో పెరుగుతుంది.పరిష్కారంలో, CT అనేది α-హెలికల్ కాన్‌స్టిట్యూటివ్ సమాంతర డైమర్17, అయితే తక్కువ pH మరియు షీర్ ఫోర్స్‌లకు ప్రతిస్పందనగా, CT విప్పుతుంది మరియు β-లేయర్‌లను స్విచ్ చేస్తుంది16, 17, బహుశా కన్వర్ట్ 16 యొక్క పునరావృత ప్రాంతాలలో β-లేయర్‌లను ప్రేరేపిస్తుంది. NT అనేది మోనోమెరిక్ కింద ఉంటుంది. గ్రంధి యొక్క ల్యూమన్‌లోని పరిస్థితులను ప్రతిబింబించే పరిస్థితులు మరియు స్పిడ్రోయిన్ యొక్క ద్రావణీయతను మధ్యవర్తిత్వం చేస్తాయి, అయితే తగ్గిన pH వద్ద, అనేక కార్బాక్సిలిక్ యాసిడ్ సైడ్ చెయిన్‌ల ప్రోటోనేషన్ సుమారు 6.5 pKaతో NT యొక్క డైమెరైజేషన్‌కు దారి తీస్తుంది, తద్వారా NT స్థిరీకరించబడుతుంది మరియు స్పిడ్రోయిన్ పెద్దగా స్థిరీకరించబడుతుంది. పరిమాణంలో.నెట్‌వర్క్‌లు16,18.ఈ విధంగా, NT ఫిలమెంట్ నిర్మాణంలో కీలక పాత్ర పోషిస్తుంది, పూతలోని మోనోమర్ నుండి ఫైబర్23,24,25లో డైమర్‌గా మారుతుంది.తేదీ16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29 వరకు అధ్యయనం చేయబడిన అన్ని పరిస్థితులలో NT అత్యంత కరిగే మరియు హెలికల్‌గా ఉంటుంది, ఇది భిన్నమైన ప్రోటీన్‌ల ఉత్పత్తికి ద్రావణీయతను పెంచే లేబుల్‌గా దాని అభివృద్ధికి ప్రేరణనిచ్చింది.
రీకాంబినెంట్ మినీ స్పైడర్ సిల్క్ ప్రొటీన్, ఒక NT, ఒక షార్ట్ రిపీట్ రీజియన్, ఒక CT మరియు శుద్దీకరణ కోసం హిస్6 ట్యాగ్ (His-NT2RepCT) కలిగి ఉంటుంది, ఇది స్థానిక స్పైడర్ సిల్క్ ప్రొటీన్ వలె సజల బఫర్‌లో కరుగుతుంది మరియు సిల్క్ స్పైడర్ యొక్క స్థానిక ముఖ్యమైన లక్షణాలను అనుకరిస్తుంది. .కవరేజ్ 25.31.అతని-NT2RepCT ఒక బయోమిమెటిక్ మెషీన్‌ని ఉపయోగించి నిరంతర ఫైబర్‌లుగా స్పిన్ చేయబడుతుంది, దీనిలో pH 8 కరిగే పూత pH 525,32,33,34,35 నీటి స్నానంలోకి విస్తరిస్తుంది.అతని-NT2RepCTని వ్యక్తీకరించే E. కోలి యొక్క బయోఇయాక్టర్ కిణ్వ ప్రక్రియ మరియు తదుపరి చికిత్స తర్వాత శుద్దీకరణ తర్వాత >14 g/L దిగుబడిని పొందింది.అధిక దిగుబడి, అధిక ద్రావణీయత మరియు ఆమ్ల పరిస్థితులకు అతని-NT2RepCT యొక్క తగిన ప్రతిస్పందన అన్నీ NT23, 25, 34కి ఆపాదించబడ్డాయి.
37 °C వద్ద ప్రోటీన్ ద్రావణాన్ని పొదిగించడం ద్వారా NT మాత్రమే సహా రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల నుండి పారదర్శక హైడ్రోజెల్స్ వేగంగా ఏర్పడటాన్ని ఇక్కడ మేము నివేదిస్తాము.థియోఫ్లేవిన్ T ఫ్లోరోసెన్స్ (ThT), ఫోరియర్ ట్రాన్స్‌ఫార్మ్ ఇన్‌ఫ్రారెడ్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (FTIR), న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (NMR) మరియు ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM)లను ఉపయోగించి, NT మరియు మైక్రోస్పైడర్ ప్రోటీన్‌లు β-like fibrils-sheets మరియు amylls-like fibrial రూపాంతరం చెందుతాయని మేము కనుగొన్నాము. జెల్లు ఏర్పడినప్పుడు.అదనంగా, NT మరియు గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) లేదా ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్ (PNP) యొక్క ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లు పూర్తిగా పనిచేసే ఫ్యూజన్ శకలాలు కలిగిన హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయి.హెటెరోలాగస్ హోస్ట్‌లలో అధిక-నిర్గమాంశ వ్యక్తీకరణ, శారీరక పరిస్థితులలో హైడ్రోజెల్‌లు వేగంగా ఏర్పడటంతో పాటు, ఇంజనీరింగ్ ఫంక్షన్‌లతో హైడ్రోజెల్‌ల ఖర్చు-సమర్థవంతమైన ఉత్పత్తికి అవకాశాన్ని తెరుస్తుంది.
అత్యధికంగా నివేదించబడిన రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల వలె కాకుండా, అతని-NT2RepCT pH 8 వద్ద Tris-HCl బఫర్‌లో స్థిరంగా ఉంటుంది మరియు అవపాతం లేకుండా 500 mg/mL వరకు కేంద్రీకరించబడుతుంది25.అందువల్ల, ఈ ప్రోటీన్ 37 ° C (Fig. 1b-d) వద్ద పొదిగినప్పుడు ఆప్టికల్‌గా స్పష్టమైన, స్వీయ-సహాయక హైడ్రోజెల్‌లను వేగంగా ఏర్పరుస్తుందని మేము ఆశ్చర్యపోయాము.తదుపరి అధ్యయనాలు అతని-NT2RepCT జిలేషన్ విస్తృత శ్రేణి ప్రోటీన్ సాంద్రతలలో (10-300 mg/mL) సంభవించిందని మరియు ఈ ఏకాగ్రత జిలేషన్ సమయంతో విలోమ సంబంధం కలిగి ఉందని చూపించింది (Fig. 1c మరియు అనుబంధ Fig. 1).అతని-NT2RepCTలోని ఏ భాగాలు హైడ్రోజెల్ ఏర్పడటానికి మధ్యవర్తిత్వం వహిస్తాయో తెలుసుకోవడానికి, మేము ప్రతి డొమైన్‌ను ఒక్కొక్కటిగా మరియు వివిధ కలయికలలో ఫ్లాస్క్ ఇన్‌వర్షన్ అస్సే (మూర్తి 1a,b) ఉపయోగించి పరిశీలించాము.అవక్షేపించిన 2Rep (Fig. 1b) మినహా 1 h కంటే తక్కువ సమయంలో రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ యొక్క అన్ని పరీక్షించిన భిన్నాలు జెల్‌లను (300 mg/mL ప్రోటీన్ సాంద్రత వద్ద) ఏర్పరుస్తాయి.NT మరియు CT మాత్రమే, కలయికలో లేదా రిపీట్‌లతో అనుబంధించబడి, 37°C వద్ద జెల్ చేయగలవని మరియు His6 ట్యాగ్ ఈ ప్రక్రియను గణనీయమైన స్థాయిలో ప్రభావితం చేయదని ఇది సూచిస్తుంది.NT అనేది అత్యంత కరిగే మరియు స్థిరమైన ప్రొటీన్ అనే సాధారణ భావన, మరియు రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ హైడ్రోజెల్స్ యొక్క మునుపటి నివేదికలు రిపీట్ రీజియన్‌లు మరియు/లేదా CTలలో ఆకృతీకరణ మార్పులకు జిలేషన్ ప్రభావాలను ఆపాదించాయి.జిలేషన్ యొక్క ఆవిష్కరణ ఊహించనిది.అనుబంధ పట్టిక 1) 37, 38, 39. విశేషమేమిటంటే, NT ఇప్పటికే ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c) సాంద్రత వద్ద 10 నిమిషాలలోపు జెల్ చేయబడింది.NT యొక్క వివిధ సాంద్రతలతో వైయల్ విలోమ ప్రయోగాలు>50 mg/mL వద్ద NT ద్రావణం సంబంధిత ఏకాగ్రత (w/v, Figure 1c) వద్ద అతని-NT2RepCT కంటే వేగంగా జెల్ చేయబడిందని చూపించింది.
ఈ పనిలో అధ్యయనం చేయబడిన వివిధ స్పిడ్రోయిన్ నిర్మాణాల స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం.b వివిధ రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రొటీన్ల (300 mg/mL) కోసం 37 °C వద్ద జెల్ సమయం సీసాని విలోమం చేయడం ద్వారా ధృవీకరించబడింది.ఇంక్యుబేషన్ లేకుండా వెంటనే CT జెల్ (<300 mg/mL), 2Rep అవక్షేపణలు (300 mg/mL, 5 mm స్కేల్).c అతని-NT2RepCT మరియు NT యొక్క జెల్ సమయం 37°C వద్ద సూచించబడిన ప్రోటీన్ సాంద్రతలలో.d స్పైడర్‌తో అతని-NT2RepCT మరియు NT హైడ్రోజెల్‌ల ఫోటోగ్రాఫ్‌లు మరియు కింద "NT" అక్షరం వరుసగా ముద్రించబడింది (రెండూ 200 mg/mL, స్కేల్ బార్ 5 మిమీ).
వివిధ రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రొటీన్‌ల ద్వారా ఏర్పడిన హైడ్రోజెల్‌లు కొద్దిగా భిన్నమైన రంగులను కలిగి ఉంటాయి మరియు కంటితో చేసిన పరిశీలన వివిధ స్థాయిలలో పారదర్శకతను చూపుతుంది (Fig. 1b).NT జెల్లు అనూహ్యంగా స్పష్టంగా ఉంటాయి, ఇతర జెల్లు అపారదర్శకంగా మారతాయి.అతని-NT2RepCT మరియు NT జెల్‌లను స్థూపాకార గొట్టాలలోకి పోసి అచ్చు చెక్కుచెదరకుండా తొలగించవచ్చు (Fig. 1d).
రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల జిలేషన్‌కు కారణమవుతుందని ఇప్పుడు కనుగొనబడిన పరిస్థితులలో సహజ స్పైడర్ సిల్క్ పూతలు జెల్ కాదా అని పరీక్షించడానికి, స్వీడిష్ బ్రిడ్జ్ స్పైడర్ (లారినియోయిడ్స్ స్క్లోపెటారియస్) యొక్క పెద్ద ఆంపుల్లా గ్రంథి నుండి పూతలు సేకరించబడ్డాయి.పూతలు 20 mM Tris-HCl బఫర్‌లో 50 mg/mL (కొలిచిన పొడి బరువు ఆధారంగా) వద్ద నిల్వ చేయబడ్డాయి, అయితే 37 ° C వద్ద 21 రోజుల పొదిగే సమయంలో ఎటువంటి జిలేషన్ గమనించబడలేదు (అనుబంధ మూర్తి 2a).
ఈ జెల్‌లను లెక్కించడానికి, జిలేషన్ ప్రక్రియను అధ్యయనం చేయడానికి మరియు మొత్తం యాంత్రిక లక్షణాలను నిర్ణయించడానికి రియోలాజికల్ కొలతలను ఉపయోగించవచ్చు.ప్రత్యేకించి, ఎలివేటెడ్ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద స్టోరేజీ మాడ్యులస్ (ఎలాస్టిసిటీ)ని పర్యవేక్షించడం వల్ల జెల్లింగ్ ఉష్ణోగ్రత మరియు పూత యొక్క విస్కోలాస్టిక్ లక్షణాలపై సమాచారాన్ని అందించవచ్చు.ఉష్ణోగ్రత పెరుగుదల ప్రయోగాలు (సహజ సిల్క్ స్టాక్ సొల్యూషన్‌లను ఉపయోగించి మునుపటి అధ్యయనాల ఆధారంగా 25-45 °C వద్ద 1°C/నిమిషానికి ఉపయోగించడం) 40,41 పెరుగుతున్న ఉష్ణోగ్రతతో అతని-NT2RepCT మరియు NT సొల్యూషన్‌ల నిల్వ మాడ్యులి పెరిగినట్లు చూపించింది.పెరిగింది (Fig. 2 మరియు అనుబంధ Fig. 3).ముఖ్యంగా, NT మాడ్యూల్ అతని-NT2RepCTతో పోలిస్తే తక్కువ ఉష్ణోగ్రత వద్ద పెరగడం ప్రారంభించింది, NT నేరుగా అతని-NT2RepCTతో 37°C వద్ద పొదిగినప్పుడు గమనించిన వేగవంతమైన జెల్ సమయానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది (మూర్తి 1).ఉష్ణోగ్రతలో తదుపరి తగ్గుదల తర్వాత, నిల్వ మాడ్యులస్ తక్కువ విలువలకు తిరిగి రాలేదు మరియు నష్టం మాడ్యులస్ కంటే ఎక్కువగా ఉంది (అనుబంధ Fig. 3 చూడండి), ఇది ఉష్ణంగా తిరిగి మార్చలేని స్థిరమైన జిలేషన్‌ను సూచిస్తుంది.జిలేషన్ తర్వాత, 100–500 mg/mL గాఢతతో అతని-NT2RepCT హైడ్రోజెల్స్‌కు చివరి సాగే మాడ్యులస్ 15 నుండి 330 kPa వరకు ఉంటుంది మరియు NT హైడ్రోజెల్స్ (100–500 mg/mL) కోసం చివరి సాగే మాడ్యులస్ 2 నుండి 14000 వరకు ఉంటుంది. kPa (Fig. , 2 మరియు పూర్తి ర్యాంప్ డేటా) అనుబంధ అంజీర్ 3 చూడండి).
అతని-NT2RepCT (300 mg/mL) మరియు b NT (300 mg/mL) యొక్క కొలతల సమయంలో ఉష్ణోగ్రతలో మార్పు వణుకుతుంది.బాణాలు ఉష్ణోగ్రత ధోరణిని సూచిస్తాయి మరియు నిల్వ మాడ్యూల్ డేటా యొక్క తేలికపాటి షేడింగ్ తయారీదారు పేర్కొన్న దానికంటే తక్కువ టార్క్ విలువలతో పరికరం కోసం పరీక్షించడాన్ని వర్ణిస్తుంది, ఇది పెరిగిన శబ్దానికి కారణం.c ఎలివేటెడ్ ఉష్ణోగ్రత (100, 300, మరియు 500 mg/mL) తర్వాత అతని-NT2RepCT మరియు NT యొక్క ముగింపు-మాడ్యూల్ చేరడం.అన్ని మాడ్యూల్ రీడింగులు 0.1 Hz ఫ్రీక్వెన్సీలో తీసుకోబడతాయి.
జిలేషన్‌తో అనుబంధించబడిన ఆకృతీకరణ మార్పులను పరిశోధించడానికి సంభావ్య పద్ధతిగా, మేము అతని-NT2RepCT మరియు NT యొక్క FTIR స్పెక్ట్రాను 37°C వద్ద జిలేషన్‌కు ముందు మరియు తర్వాత రికార్డ్ చేసాము (మూర్తి 3a,b).ఊహించినట్లుగా, అతని-NT2RepCT మరియు NT సొల్యూషన్‌ల స్పెక్ట్రా 1645 cm-1 వద్ద ఉచ్ఛరించే బ్యాండ్‌తో α-హెలిక్స్/రాండమ్ కాయిల్ సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌ను చూపించే ప్రోటీన్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.రెండు హైడ్రోజెల్‌ల కోసం, జిలేషన్ ఫలితంగా I బ్యాండ్ మధ్యలో 1617 cm-1 మరియు 1695 cm-1 (Fig. 3a, b) వద్ద రెండు చేతులు ఏర్పడ్డాయి, ఇది వ్యతిరేక సమాంతర β-షీట్ నిర్మాణాల ఏర్పాటును సూచిస్తుంది.ఈ మార్పులు సంబంధిత సెకండ్ డెరివేటివ్ మరియు డిఫరెన్స్ జిలేషన్ స్పెక్ట్రా (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4 బి)లో కూడా స్పష్టంగా చూడవచ్చు.NT β-లేయర్ యొక్క రెండు బ్యాండ్‌లు అతని-NT2RepCT కంటే ఎక్కువగా ఉచ్ఛరించబడ్డాయి, NT హైడ్రోజెల్‌లోని β-లేయర్ బ్యాండ్‌ల మొత్తం కంటెంట్ NT2RepCT హైడ్రోజెల్ కంటే ఎక్కువగా ఉందని సూచిస్తుంది.
అతని-NT2RepCT మరియు b NT (రెండూ 500 mg/mL) యొక్క FTIR శోషణ స్పెక్ట్రా (రెండూ 500 mg/mL) ముందు (పరిష్కారం) మరియు తర్వాత (జెల్) 37 ° C వద్ద ఇంక్యుబేషన్.50 mg/ml NT2RepCT జెల్లు మరియు d NT యొక్క c TEM చిత్రాలు పునఃసృష్టించబడ్డాయి.స్కేల్ బార్ 200 nm.అతని-NT2RepCT మరియు NT హైడ్రోజెల్స్ యొక్క ఇ ఫైబర్ వ్యాసాలు.n = 100 కొలిచిన ఫైబ్రిల్స్, p <0.0001.లోపం పట్టీలు ప్రామాణిక విచలనాన్ని చూపుతాయి.లోపం పట్టీల మధ్యభాగం సగటు.గణాంక విశ్లేషణ కోసం జత చేయని t- పరీక్ష (రెండు-తోక) ఉపయోగించబడింది.f 37 °C వద్ద వివిధ రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్ల (100 mg/mL) యొక్క ThT ఫ్లోరోసెన్స్ వణుకు లేకుండా.0%, 5%, 10% మరియు 20% విత్తనాలతో 100 mg/mL NT జెల్ నుండి g NT (100 mg/mL) టీకాల ప్రయోగాలు.
ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) ఉపయోగించి జెల్ యొక్క విశ్లేషణ హైడ్రోజెల్ అమిలాయిడ్-వంటి ఫైబ్రిల్స్ (Fig. 3c, 3d) కలిగి ఉందని చూపించింది.NT-ఏర్పడిన ఫైబ్రిల్స్ పొడుగుగా (5-12 nm వ్యాసంలో) మరియు శాఖారహితంగా ఉంటాయి, అయితే అతని-NT2RepCT ఫైబ్రిల్స్ పొడవు తక్కువగా మరియు వ్యాసంలో (7-16 nm) గణనీయంగా వెడల్పుగా ఉంటాయి (Fig. 3e).ఈ ఫలితాలు థియోఫ్లావిన్ T (ThT) పరీక్షను ఉపయోగించి ఫైబ్రోసిస్ యొక్క గతిశాస్త్రాన్ని అనుసరించడానికి మాకు అనుమతినిచ్చాయి.అన్ని రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌లకు, నమూనాలను 37 °C వద్ద పొదిగినప్పుడు ఫ్లోరోసెంట్ సిగ్నల్ పెరిగింది (Fig. 3f, అనుబంధ Fig. 5a).ఈ అన్వేషణకు అనుగుణంగా, జెల్లింగ్ పరిస్థితులలో NT మరియు His-NT2RepCT యొక్క మైక్రోస్కోపిక్ పరీక్షలో ThT-పాజిటివ్ కంకరల (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5b,c) గుర్తించదగిన స్థానిక సంచితం లేకుండా ThT ఫ్లోరోసెన్స్‌లో ఏకరీతి పెరుగుదల కనిపించింది.ThT-పాజిటివ్ ఫైబ్రిల్స్ ఏర్పడటం అనేది NT మరియు అతని-NTCT టర్బిడిటీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5d) పెరుగుదలతో కలిసి ఉండదు, అంటే జెల్‌లోని ఫైబ్రిల్స్ నెట్‌వర్క్ జెల్ స్పష్టతకు రాజీ పడకుండా ఏర్పడుతుంది.ముందుగా ఏర్పడిన ఫైబ్రిల్స్‌ను చిన్న మొత్తాలను జోడించడం ద్వారా విత్తనాలు వేయడం వలన కొన్ని అమిలాయిడ్‌లు 42,43,44 ఫైబ్రిల్ ఏర్పడటాన్ని గణనీయంగా వేగవంతం చేయవచ్చు కానీ NT హైడ్రోకోగ్యులెంట్‌ల ద్రావణానికి 5%, 10% లేదా 20% (w/w) NTని జోడించవచ్చు.విత్తనాల ప్రభావం (Fig. 3g).హైడ్రోజెల్‌లోని ఫైబ్రిల్స్ సాపేక్షంగా స్థిరంగా ఉండటం మరియు వాటిని విత్తనాలుగా ఉపయోగించలేకపోవడం దీనికి కారణం కావచ్చు.
అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క ఊహించని ప్రవర్తన జెల్ ఏర్పడటానికి సంబంధించిన మార్పులను గుర్తించడానికి మరింత న్యూక్లియర్ మాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ (NMR) స్పెక్ట్రోస్కోపీ అధ్యయనాలను ప్రేరేపించింది.37°C వద్ద కాలక్రమేణా రికార్డ్ చేయబడిన His-NT2RepCT సొల్యూషన్స్ యొక్క NMR స్పెక్ట్రా CT ఇప్పటికీ పాక్షికంగా ముడుచుకున్నట్లు చూపింది, అయితే NT మరియు 2Rep సంకేతాలు అదృశ్యమయ్యాయి (Fig. 4a), ఇది ప్రధానంగా NT మరియు 2Rep లు అతని-ని పాక్షికంగా నియంత్రిస్తున్నాయని సూచిస్తున్నాయి. NT2RepCT హైడ్రోజెల్.CT సిగ్నల్ కూడా దాని అసలు తీవ్రతలో 20%కి అటెన్యూట్ చేయబడింది, CT కూడా ఎక్కువగా స్థిరంగా ఉండి హైడ్రోజెల్ నిర్మాణంలో చేర్చబడిందని సూచిస్తుంది.CT యొక్క చిన్న భాగానికి, ఇది ప్రీఇన్‌క్యుబేటెడ్ శాంపిల్‌లో వలె మొబైల్‌గా ఉంటుంది మరియు ఆ విధంగా పరిష్కారం NMR ద్వారా గమనించబడుతుంది, స్పెక్ట్రా మొదటి 10 నిర్మాణాత్మక అవశేషాలకు సంకేతాలను కలిగి ఉండదు, బహుశా అతని-NT2Rep యొక్క జోడించిన భాగం యొక్క కష్టమైన స్థిరీకరణ కారణంగా కావచ్చు.-స్టేట్ ఆఫ్ హైడ్రోజెల్స్ -NT2RepCT యొక్క NMR స్పెక్ట్రా α-హెలిక్స్ మరియు β-లేయర్‌ల యొక్క ప్రధాన ఉనికిని మరియు కొంతవరకు, యాదృచ్ఛిక కాయిల్ కన్ఫర్మేషన్ (Fig. 4b)ని వెల్లడించింది.NTలో మాత్రమే ఉన్న మెథియోనిన్ అవశేషాల యొక్క రసాయన మార్పు విశ్లేషణ ఈ డొమైన్ β-షీట్ నిర్మాణంగా మార్చబడిందని చూపించింది.ద్రావణంలో NT యొక్క సమయ-ఆధారిత స్పెక్ట్రా సిగ్నల్ తీవ్రతలో ఏకరీతి తగ్గుదలని చూపింది (Fig. 4c), మరియు NT హైడ్రోజెల్స్ యొక్క ఘన-స్థితి NMR చాలా NT అవశేషాలను β-షీట్ నిర్మాణాలుగా మార్చినట్లు చూపింది (Fig. 4d).2Rep యొక్క సమ్మేళన ధోరణి కారణంగా విడిగా నిర్ణయించబడలేదు.అయినప్పటికీ, NTCT మరియు His-NT2RepCT హైడ్రోజెల్స్ యొక్క ఘన స్థితి NMR స్పెక్ట్రా చాలా సారూప్యతను కలిగి ఉంది (Fig. 4b; అనుబంధ Fig. 6b), హిస్-NT2RepCT హైడ్రోజెల్ యొక్క నిర్మాణ భాగానికి 2Rep తక్కువ సహకారం అందించిందని సూచిస్తుంది.CT హైడ్రోజెల్స్ కోసం, α-హెలిక్స్, β-షీట్‌లు మరియు యాదృచ్ఛిక హెలికల్ సెకండరీ స్ట్రక్చర్‌లు ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది (అనుబంధ Fig. 6d).CTలోని కొన్ని భాగాలు α-హెలిక్స్‌గా మిగిలిపోతాయని, మరికొన్ని β-షీట్‌లుగా మారుతాయని ఇది సూచిస్తుంది.అందువలన, NMR స్పెక్ట్రోస్కోపీ ఫలితాలు హైడ్రోజెల్ ఏర్పడటానికి NT ముఖ్యమైనదని మరియు 2Rep మరియు CTతో కలయికపై β-షీట్ కన్ఫర్మేషన్‌గా రూపాంతరం చెందుతుందని సూచిస్తున్నాయి.దీనికి అనుగుణంగా, NT డొమైన్‌లోని మొత్తం ఐదు హెలిక్‌లలో అమిలాయిడ్ స్పేషియల్ జిప్పర్‌లు ఏర్పడే అవకాశం ఉందని మేము ఇటీవల కనుగొన్నాము మరియు వాల్ట్జ్ అల్గోరిథం హెలిక్స్ 1 (Fig. 4e)లో అమిలోయిడోజెనిక్ ప్రాంతాన్ని అంచనా వేసింది.
2D స్పెక్ట్రా 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ద్రావణం ముందు (నీలం) మరియు 19 గంటల తర్వాత పొదిగే (ఎరుపు) 37°C వద్ద.ఎరుపు వర్ణపటంలోని వ్యక్తిగత క్రాస్ శిఖరాలు మరియు నీలిరంగులో F24, G136, polyA ఒకే అక్షరం అమైనో ఆమ్లం చిహ్నాలు మరియు అవశేష సంఖ్యల ద్వారా సూచించబడతాయి.NT, 2Rep మరియు CT డొమైన్‌ల నుండి ఎంచుకున్న అవశేషాల కోసం సమయానికి సిగ్నల్ తీవ్రత యొక్క ఆధారపడటాన్ని ఇన్‌సెట్‌లు చూపుతాయి.b అతని-NT2RepCT హైడ్రోజెల్స్ యొక్క సాలిడ్-స్టేట్ రేడియో ఫ్రీక్వెన్సీ (RFDR) స్పెక్ట్రా.RFDR స్పెక్ట్రాలో గమనించిన Cα/Cβ అవశేషాల సహసంబంధాలు మోడల్ పెప్టైడ్ రసాయన మార్పులు మరియు గణాంకాలు 82,83 మరియు వాటి ద్వితీయ నిర్మాణాల నుండి పొందిన విలువలతో పోల్చడం ద్వారా నిర్ణయించబడ్డాయి.SSB - తిరిగే సైడ్‌బ్యాండ్.c 36 గంటల పాటు 37 °C వద్ద పొదిగే సమయంలో 15N-HSQC 10 mg/mL NT ద్రావణం యొక్క వన్-డైమెన్షనల్ స్పెక్ట్రా.ఇన్సెట్ వాల్యూమెట్రిక్ తీవ్రత మరియు సమయం చూపిస్తుంది.d NT హైడ్రోజెల్స్ యొక్క ఘన స్థితి RFDR స్పెక్ట్రా.RFDR స్పెక్ట్రాలో గమనించిన Cα/Cβ అవశేషాల సహసంబంధాలు మరియు వాటి ద్వితీయ నిర్మాణాలు సూచించబడ్డాయి.ఇ Zipper డేటాబేస్ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) నుండి NT45.79 ఫిబ్రిలేషన్ ప్రవృత్తి ప్రొఫైల్ ఆధారంగా.హెక్సాపెప్టైడ్ యొక్క ప్రాదేశిక మెరుపు మార్పు విండో యొక్క రోసెట్టా శక్తి kcal/molలో చూపబడింది.రెడ్ బార్‌లు హెక్సాపెప్టైడ్‌లను అధిక ఫైబ్రోసిస్ ప్రవృత్తితో సూచిస్తాయి (రోసెట్టా ఎనర్జీ క్రింద -23 కిలో కేలరీలు/మోల్; చుక్కల రేఖకు దిగువన).గ్రీన్ బార్‌లు థ్రెషోల్డ్ పైన ఉన్న రోసెట్టా ఎనర్జీలతో కూడిన శకలాలను సూచిస్తాయి మరియు అందువల్ల స్టెరిక్ జిప్పర్‌లు ఏర్పడే అవకాశం తక్కువ.ప్రోలిన్ ఉన్న శకలాలు విశ్లేషణ నుండి మినహాయించబడ్డాయి (నిలువు వరుసలు లేకుండా).వాల్ట్జ్ అల్గోరిథం81 (https://waltz.switchlab.org) ద్వారా అంచనా వేయబడిన అమిలోయిడోసిస్ ప్రాంతాలను చతురస్రాలు సూచిస్తాయి.NT యొక్క అమైనో ఆమ్ల అవశేషాల క్రమం ఎగువన ఉంది మరియు β ద్వితీయ నిర్మాణంలో (ఘన-స్థితి NMR స్పెక్ట్రోస్కోపీ ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది) కనిపించే అవశేషాల రకాలు ఎరుపు రంగులో చూపబడ్డాయి.ఐదు NT α-హెలిక్‌ల స్థానాలు (H1-H5)28గా పేర్కొనబడ్డాయి.
pH <6.5 వద్ద, HT డైమెరైజ్ అవుతుంది, ఇది వేడి లేదా యూరియా-ప్రేరిత డీనాటరేషన్‌కు నిరోధకతను కలిగి ఉంటుంది.NT డైమెరైజేషన్ మరియు స్టెబిలిటీ జిలేషన్‌ను ఎలా ప్రభావితం చేస్తాయో వివరించడానికి, 100 mg/ml NT కలిగిన సొల్యూషన్‌లు pH 8, 7 మరియు 6 వద్ద పగిలి విలోమ పరీక్షను ఉపయోగించి నియంత్రించబడతాయి.NT నమూనాలు pH 8 మరియు 7 వద్ద 30 నిమిషాల తర్వాత 37 °C వద్ద జెల్ చేయబడ్డాయి, అయితే pH 8 జెల్ స్పష్టంగా ఉంది, అయితే pH 7 జెల్ కనిపించే అవక్షేపాన్ని చూపింది (Fig. 5a).దీనికి విరుద్ధంగా, pH 6 వద్ద HTని కలిగి ఉన్న ఒక పరిష్కారం జెల్‌ను ఏర్పరచలేదు మరియు 37 ° C వద్ద 20 నిమిషాల తర్వాత పెద్ద అవక్షేపం చూడవచ్చు.మోనోమర్‌లతో పోలిస్తే డైమర్‌లు మరియు/లేదా వాటి అధిక స్థిరత్వం జిలేషన్‌ను నిరోధిస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది.NT 200 mg/ml27 వద్ద కరుగుతుందని నివేదించబడినందున, 200 mg/ml27 వద్ద NT కోసం అవక్షేపం ఏర్పడుతుందని ఊహించలేదు, ఉష్ణ డీనాటరేషన్ తర్వాత సులభంగా రీఫోల్డ్ అవుతుంది మరియు తక్కువ విలువలలో α-హెలిక్స్‌ను కలిగి ఉంటుంది. pH 18. ఈ వ్యత్యాసాలకు సంభావ్య వివరణ ఏమిటంటే, గతంలో నివేదించబడిన ప్రయోగాలు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద లేదా అంతకంటే తక్కువ లేదా సాపేక్షంగా తక్కువ ప్రొటీన్ సాంద్రతలు16,18,19 వద్ద జరిగాయి.
37°C వద్ద పొదిగిన తర్వాత pH 8, 7, 6 మరియు 154 mM NaCl (pH 8) వద్ద NT పగిలి విలోమ పరీక్ష (100 mg/mL).b NT CD స్పెక్ట్రా వరుసగా 154 mM NaF మరియు 154 mM NaCl తో మరియు లేకుండా.222 nm వద్ద మోలార్ ఎలిప్టిసిటీ సహజ మడతల నిష్పత్తికి మార్చబడుతుంది.c NT ఇన్వర్షన్ అస్సే (100 mg/mL) NT* (37 °C మరియు 60 °C), NTA72R (37 °C), మరియు His-NT-L6 (37 °C మరియు 60 °C).NT మార్పుచెందగల NT*, NTA72R మరియు అతని-NT-L6 యొక్క d CD స్పెక్ట్రా.222 nm వద్ద మోలార్ ఎలిప్టిసిటీ సహజ మడతల నిష్పత్తికి మార్చబడుతుంది.ఇ NTFlSp, NTMiSp మరియు తగ్గిన NTMiSp (100 mg/mL) యొక్క విలోమ పరీక్ష.స్కేల్ బార్ 5 మిమీ.NT, NTFlSp, NTMiSp మరియు తగ్గిన NTMiSp యొక్క f CD స్పెక్ట్రా.222 nm వద్ద మోలార్ ఎలిప్టిసిటీ సహజ మడతల నిష్పత్తికి మార్చబడుతుంది.25 °C మరియు 95 °C వద్ద పూర్తి NT స్పెక్ట్రా అనుబంధ మూర్తి 8లో చూపబడింది.
ఫిజియోలాజికల్ ఉప్పు ఏకాగ్రత NT సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఇంటరాక్షన్‌లను మరియు తక్కువ pH18కి NT బదిలీని డైమెరైజేషన్ నిర్ణయిస్తుంది.మేము 154 mM NaCl మరియు NaF యొక్క ఉనికిని నిజానికి జిలేషన్‌ను నిరోధిస్తుందని కనుగొన్నాము, (Fig. 5a, b; అనుబంధ Fig. 2b) మరియు ఈ లవణాలు NT మోనోమర్‌ల యొక్క ఉష్ణ స్థిరత్వాన్ని పెంచాయని (Fig. 5b, అనుబంధ Fig. 8) .డైమెరైజేషన్ కాకుండా స్థిరత్వ మెరుగుదల, జెల్ ఏర్పడటాన్ని నిరోధిస్తుందని కూడా ఇది సూచిస్తుంది.
జిలేషన్‌లో ప్రోటీన్ డైమెరైజేషన్ మరియు స్థిరత్వం యొక్క పాత్రను మరింత అన్వేషించడానికి, మేము NT* మరియు NTA72R అనే రెండు మార్పుచెందగలవారిని ఉపయోగించాము, ఇవి కూడా తక్కువ pH28.30 వద్ద మోనోమెరిక్‌గా ఉంటాయి.NT* అనేది డబుల్ చార్జ్ రివర్సల్ మ్యూటాంట్, దీనిలో మోనోమర్ యొక్క స్పష్టమైన ద్విధ్రువ ఛార్జ్ పంపిణీ చదును చేయబడుతుంది, ఇది డైమెరైజేషన్‌ను నిరోధిస్తుంది మరియు మోనోమర్ స్థిరత్వాన్ని తీవ్రంగా పెంచుతుంది.NTA72R అనేది ఛార్జ్ చేయబడిన ద్విధ్రువం, కానీ Arg-ప్రత్యామ్నాయ Ala డైమర్ సరిహద్దు వద్ద ఉంది, కాబట్టి ఉత్పరివర్తనలు డైమెరైజేషన్‌కు అవసరమైన సబ్‌యూనిట్ పరస్పర చర్యలతో జోక్యం చేసుకుంటాయి.37°C వద్ద పొదిగిన తర్వాత, NT* హైడ్రోజెల్‌ను ఏర్పరచలేదు, అయితే NTA72R 15 నిమిషాల పాటు అపారదర్శక జెల్‌ను ఏర్పరుస్తుంది (Fig. 5c).NT* మరియు NTA72R రెండూ డైమెరైజ్ చేయలేవు కానీ మోనోమర్ స్థిరత్వం (Fig. 5d)లో విభిన్నంగా ఉంటాయి కాబట్టి, అధిక థర్మోడైనమిక్ స్థిరత్వం NT ను జెల్లింగ్ నుండి నిరోధిస్తుందని ఈ ఫలితాలు గట్టిగా సూచిస్తున్నాయి.HT* అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద అస్థిరంగా ఉన్నప్పుడు (60°C వద్ద 8 నిమిషాల తర్వాత; Fig. 5c) జెల్‌ను ఏర్పరుస్తుంది అనే వాస్తవం కూడా దీనికి మద్దతు ఇస్తుంది.NTలో మెథియోనిన్ యొక్క అధిక కంటెంట్ దాని సహజమైన మడతను ద్రవీకరిస్తుంది మరియు ఆరు మెట్ టు లెయు ప్రత్యామ్నాయాలు (ఇక్కడ అతని-NT-L6గా సూచిస్తారు) NT46 మోనోమర్‌ను బలంగా స్థిరీకరిస్తాయని గతంలో చూపబడింది.NT జెల్ ఏర్పడటానికి స్ట్రక్చరల్ ఫ్లెక్సిబిలిటీ అవసరమనే ఊహ ఆధారంగా, అతని-NT-L6 స్థిరమైన ఉత్పరివర్తన 37 °C వద్ద జెల్ చేయలేదని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి 5 సి, డి).అయినప్పటికీ, అతని-NT-L6 కూడా 60 నిమిషాలకు 60 ° C వద్ద పొదిగేటప్పుడు ఒక జెల్‌ను ఏర్పరుస్తుంది (Fig. 5c).
NT β-షీట్ స్ట్రక్చర్‌లుగా రూపాంతరం చెంది హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరచగల సామర్థ్యం స్పిడ్రోయిన్ యొక్క అన్ని NT డొమైన్‌లకు వర్తించదు.వివిధ పట్టు రకాలు మరియు స్పైడర్ జాతుల నుండి NTలు, ట్రైకోనెఫిలా క్లావిప్స్ (NTFlSp), సాపేక్షంగా తక్కువ మెథియోనిన్ కంటెంట్ మరియు అధిక ఉష్ణ స్థిరత్వం (Fig. 5e, f మరియు అనుబంధ పట్టిక 2) ఉన్నప్పటికీ జెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయి.దీనికి విరుద్ధంగా, తక్కువ ఉష్ణ స్థిరత్వం మరియు అధిక మెథియోనిన్ కంటెంట్‌తో అరేనియస్ వెంట్రికోసస్ (NTMiSp) నుండి చిన్న ఆంపుల్లర్ ప్రోటీన్ స్పిడ్రోయిన్ నుండి NT హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరచలేదు (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 2 మరియు ఫిగ్. 5e, f).రెండోది ఇంట్రామోలెక్యులర్ డైసల్ఫైడ్ బాండ్ల ఉనికితో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు29,47.స్థిరంగా, NTMiSp యొక్క డైసల్ఫైడ్ బంధాలు తగ్గించబడినప్పుడు, అది 10 నిమిషాలు (Fig. 5e) 37 ° C వద్ద పొదిగిన తర్వాత హైడ్రోజెల్‌ను ఏర్పరుస్తుంది.ముగింపులో, NT నుండి జెల్ ఏర్పడటానికి నిర్మాణాత్మక వశ్యత ముఖ్యమైనది, కానీ ఏకైక ప్రమాణం కాదని గమనించాలి.సంబంధితంగా ఉండే మరో అంశం అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్‌ను ఏర్పరుచుకునే ప్రవృత్తి, మరియు జిప్పర్ డేటాబేస్ మరియు వాల్ట్జ్ అల్గారిథమ్‌తో విశ్లేషణ జెల్‌లను ఏర్పరుచుకునే సామర్థ్యం మరియు అమిలోయిడోజెనిక్ ప్రాంతాల ఉనికి, అలాగే అంచనా వేసిన ప్రాంతాల పరిధి మధ్య పరస్పర సంబంధాన్ని చూపించింది. స్టెరిక్ జిప్పర్‌లను రూపొందించడానికి.ఒక సహసంబంధం ఉంది (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 2 మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 9).
అనుకూలమైన పరిస్థితులలో ఫైబ్రిల్స్‌ను ఏర్పరచడానికి మరియు జెల్‌లను ఏర్పరచడానికి NT యొక్క సామర్థ్యం ఇతర ప్రోటీన్ శకలాలు కలిగిన NT ఫ్యూషన్‌లు ఇప్పటికీ ఫ్యూజన్ భాగస్వాముల పూర్తి పనితీరుతో జెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయని మేము ఊహిస్తున్నాము.దీన్ని పరీక్షించడానికి, మేము వరుసగా NT యొక్క సి-టెర్మినస్ వద్ద గ్రీన్ ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోటీన్ (GFP) మరియు ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్ (PNP)లను పరిచయం చేసాము.ఫలితంగా ఏర్పడిన ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లు E. coliలో చాలా ఎక్కువ తుది దిగుబడితో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి (వరుసగా అతని-NT-GFP మరియు అతని-NT-PNP కోసం 150 mg/L మరియు 256 mg/L షేక్ ఫ్లాస్క్ కల్చర్‌లు), చూపిన వాటికి అనుగుణంగా ఉంటాయి. NT Refకు సంలీనమైన ఇతర ప్రోటీన్ల కోసం.30. అతని-NT-GFP (300mg/mL) మరియు అతని-NT-PNP (100mg/mL) ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్లు 2 గంటల మరియు 6.5 గంటల తర్వాత 37 ° C వద్ద జెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయి మరియు ముఖ్యంగా, GFP భిన్నం మారలేదు.జిలేషన్ తర్వాత గమనించబడింది, > 70% ప్రారంభ ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత జిలేషన్ తర్వాత మిగిలి ఉంది (Fig. 6a).అతని-NT-PNP సొల్యూషన్‌లు మరియు జెల్‌లలో PNP కార్యాచరణను కొలవడానికి, మేము ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌ను NTతో పలుచన చేయాల్సి వచ్చింది, ఎందుకంటే స్వచ్ఛమైన తయారీ యొక్క ఎంజైమాటిక్ కార్యాచరణ జెల్లింగ్ సాంద్రతలలో పరీక్ష యొక్క గుర్తింపు పరిధికి వెలుపల ఉంది.0.01 mg/mL అతని-NT-PNP మరియు 100 mg/mL NT కలిగిన మిశ్రమంతో ఏర్పడిన జెల్ ప్రీఇన్‌క్యుబేట్ నమూనాల ప్రారంభ ఎంజైమాటిక్ చర్యలో 65% నిలుపుకుంది (Fig. 6b).కొలత సమయంలో జెల్ చెక్కుచెదరకుండా ఉంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 10).
హిస్-NT-GFP (300 mg/mL) యొక్క జిలేషన్‌కు ముందు మరియు తర్వాత సాపేక్ష ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత మరియు కనిపించే మరియు UV కాంతి కింద అతని-NT-GFP హైడ్రోజెల్ (300 mg/mL) కలిగిన విలోమ పగిలి.పాయింట్లు వ్యక్తిగత కొలతలను చూపుతాయి (n = 3), ఎర్రర్ బార్‌లు ప్రామాణిక విచలనాన్ని చూపుతాయి.సగటు విలువ లోపం పట్టీల మధ్యలో చూపబడింది.b PNP కార్యాచరణ NT (100 mg/ml) మరియు 0.01 mg/ml హిస్-NT-PNP మరియు 100 mg/ml న్యూ తైవాన్ డాలర్లను కలిగి ఉన్న ద్రావణాలు మరియు జెల్‌లను ఉపయోగించి ఫ్లోరోమెట్రిక్ విశ్లేషణ ద్వారా పొందబడింది.ఇన్సెట్ హిస్-ఎన్‌టి-పిఎన్‌పి (5 మిమీ స్కేల్ బార్) కలిగిన హైడ్రోజెల్‌ను కలిగి ఉన్న విలోమ పగిలిని చూపుతుంది.
ఇక్కడ, 37 ° C వద్ద ప్రోటీన్ ద్రావణాన్ని పొదిగించడం ద్వారా NT మరియు ఇతర రీకాంబినెంట్ స్పిడ్రోయిన్ ప్రోటీన్‌ల నుండి హైడ్రోజెల్స్ ఏర్పడటాన్ని మేము నివేదిస్తాము (మూర్తి 1).α-హెలిక్స్‌లను β-పొరలుగా మార్చడం మరియు అమిలాయిడ్-వంటి ఫైబ్రిల్స్ ఏర్పడటం (Fig. 3 మరియు 4)తో జిలేషన్ అనుబంధించబడిందని మేము చూపిస్తాము.NT లు కాయిల్డ్ గ్లోబులర్ ఫైవ్-హెలిక్స్ బండిల్‌లు వాటి అత్యంత అధిక ద్రావణీయత మరియు అధిక స్థిరత్వం > 200 mg/mL వద్ద 4°C వద్ద చాలా రోజుల పాటు స్థిరత్వం కలిగి ఉంటాయి కాబట్టి ఈ అన్వేషణ ఆశ్చర్యకరమైనది.అదనంగా, NT లు µMలో తక్కువ ప్రోటీన్ సాంద్రతల వద్ద వేడి డీనాటరేషన్ తర్వాత తక్షణమే రీఫోల్డ్ అవుతాయి.మా ఫలితాల ప్రకారం, ఫైబ్రిల్ ఏర్పడటానికి>10 mg/mL ప్రోటీన్ సాంద్రత మరియు కొద్దిగా పెరిగిన ఉష్ణోగ్రత (Fig. 1) కలయిక అవసరం.శారీరక పరిస్థితులలో థర్మల్ హెచ్చుతగ్గుల కారణంగా పాక్షికంగా ముడుచుకున్న స్థితిలో ఉన్న గ్లోబులర్‌గా మడతపెట్టిన ప్రోటీన్‌ల నుండి అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ ఏర్పడతాయనే ఆలోచనతో ఇది స్థిరంగా ఉంటుంది [48] .ఇన్సులిన్ 49,50, β2-మైక్రోగ్లోబులిన్, ట్రాన్స్‌థైరెటిన్ మరియు లైసోజైమ్51,52,53 వంటివి ఈ మార్పిడికి గురయ్యే ప్రోటీన్‌ల ఉదాహరణలు.NT దాని స్థానిక స్థితిలో α-హెలిక్స్ అయినప్పటికీ, దాదాపు 65% పాలీపెప్టైడ్ గొలుసు స్టెరిక్ జిప్పర్ ఫార్మేషన్‌తో అనుకూలంగా ఉంటుంది (Fig. 4e) 45 .మోనోమర్ డైనమిక్‌గా మొబైల్ 46 కాబట్టి, ఇది ఈ సంభావ్య అమిలోయిడోజెనిక్ ప్రాంతాలను మధ్యస్తంగా ఎత్తైన ఉష్ణోగ్రతల వద్ద బహిర్గతం చేయగలదు మరియు మొత్తం ప్రోటీన్ యొక్క అధిక సాంద్రతలలో అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్ ఏర్పడటానికి క్లిష్టమైన సాంద్రతను చేరుకోగలదు.ఈ తార్కికాన్ని అనుసరించి, మేము స్పిడ్రోయిన్ ఏకాగ్రత మరియు జిలేషన్ సమయం (Fig. 1c) మధ్య ప్రతికూల సహసంబంధాన్ని కనుగొన్నాము మరియు మోనోమెరిక్ NT కన్ఫర్మేషన్ మ్యుటేషన్‌ల ద్వారా (NT*, His-NT-L6) లేదా ఉప్పు చేరిక ద్వారా స్థిరీకరించబడితే, నిరోధించవచ్చు ఏర్పాటు హైడ్రోజెల్స్ (Fig. 5).
చాలా సందర్భాలలో, అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ ద్రావణం నుండి అవక్షేపంగా అదృశ్యమవుతాయి, అయితే కొన్ని పరిస్థితులలో అవి హైడ్రోజెల్స్ 55,56,57ను ఏర్పరుస్తాయి.హైడ్రోజెల్-ఫార్మింగ్ ఫైబ్రిల్స్ సాధారణంగా అధిక కారక నిష్పత్తిని కలిగి ఉంటాయి మరియు మా ఫలితాలకు అనుగుణంగా మాలిక్యులర్ ఎంటాంగిల్‌మెంట్ ద్వారా స్థిరమైన త్రిమితీయ నెట్‌వర్క్‌లను ఏర్పరుస్తాయి, 55,58.విట్రోలో హైడ్రోజెల్ ఏర్పడటానికి, ప్రొటీన్లు తరచుగా పూర్తిగా లేదా పాక్షికంగా విప్పబడతాయి, ఉదాహరణకు, సేంద్రీయ ద్రావకాలు, అధిక ఉష్ణోగ్రత (70–90°C) మరియు/లేదా తక్కువ pH (1.5–3.0)59,60,61,62కి గురికావడం ద్వారా.ఇక్కడ వివరించిన స్పిడ్రోయిన్ హైడ్రోజెల్‌లకు కఠినమైన ప్రాసెసింగ్ అవసరం లేదు లేదా హైడ్రోజెల్‌లను స్థిరీకరించడానికి క్రాస్-లింకింగ్ ఏజెంట్లు అవసరం లేదు.
సిల్క్ స్పిన్నింగ్ సమయంలో β-షీట్ మార్పిడికి గురైనట్లు కనిపించే స్పిడ్రోయిన్ రిపీట్‌లు మరియు క్యూడిలు హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరుస్తాయని గతంలో నివేదించబడింది.మా పరిశోధనలతో పోలిస్తే, పొదిగే సమయాలు మరియు/లేదా ఇంక్యుబేషన్ ఉష్ణోగ్రతలు వరుసగా ఎక్కువ లేదా ఎక్కువ, మరియు ఫలితంగా హైడ్రోజెల్‌లు తరచుగా అపారదర్శకంగా ఉంటాయి (మూర్తి 7 మరియు అనుబంధ పట్టిక 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. వేగవంతమైన జెల్ సమయాలతో పాటు, NT హైడ్రోజెల్స్ >300 mg/mL (30%) అన్ని ఇతర వివరించిన రీకాంబినెంట్ స్పైడర్ సిల్క్ ప్రోటీన్ హైడ్రోజెల్‌లను, అలాగే జెలటిన్, ఆల్జినేట్ (2%), అగర్ (0.5 %) వంటి సహజ హైడ్రోజెల్‌లను అధిగమించాయి. ) మరియు కొల్లాజెన్.(0.6%) (మూర్తి 7 మరియు అనుబంధ పట్టికలు 1 మరియు 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
ఈ అధ్యయనంలో హైడ్రోజెల్‌ల యొక్క జెల్ సమయం మరియు సాగే మాడ్యులస్‌ను ఇతర స్పిడ్రోయిన్-ఆధారిత హైడ్రోజెల్‌లు మరియు ఎంచుకున్న సహజ హైడ్రోజెల్‌లతో పోల్చారు.జిలేషన్ పరిస్థితుల వివరణతో పాటు సూచనలు ఇవ్వబడ్డాయి.APS అమ్మోనియం పెర్సల్ఫేట్, గది ఉష్ణోగ్రత.డేటా 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
స్పైడ్రోయిన్ నిల్వ సమయంలో జెల్లింగ్ నుండి నిరోధించడానికి స్పైడర్స్ మార్గాలను అభివృద్ధి చేసినట్లు కనిపిస్తుంది.పట్టు గ్రంథిలో ప్రోటీన్ యొక్క అధిక సాంద్రత ఉన్నప్పటికీ, టెర్మినల్ డొమైన్‌తో అనుబంధించబడిన పెద్ద పునరావృత ప్రాంతం అంటే గ్రంథిలో NT మరియు CT యొక్క స్పష్టమైన సాంద్రత ఈ అధ్యయనం యొక్క సరిహద్దు వద్ద సుమారు 10-20 mg/mlకి అనుగుణంగా ఉంటుంది.ఇన్ విట్రో పరిశీలించిన హైడ్రోజెల్ ఏర్పడటానికి అవసరం.అదనంగా, పట్టు గ్రంధులలో (Fig. 5b) వలె లవణాల సారూప్య సాంద్రతలు 16 NT స్థిరీకరించబడ్డాయి.NT కన్ఫర్మేషన్ E. coli సైటోసోల్‌లో అధ్యయనం చేయబడింది మరియు విట్రోలో పరిశీలించినప్పుడు కంటే మరింత గట్టిగా ముడుచుకున్నట్లు కనుగొనబడింది, ఉప్పు లేదా ఇతర కారకాలు వివోలో దాని సంకలనాన్ని నిరోధిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి.అయినప్పటికీ, NTలు β-షీట్ ఫైబ్రిల్స్‌గా రూపాంతరం చెందగల సామర్థ్యం ఫిలమెంట్ ఏర్పడటానికి ముఖ్యమైనది కావచ్చు మరియు భవిష్యత్ అధ్యయనాలలో పరిశోధించాలి.
ఈ అధ్యయనంలో గమనించిన NT-అమిలాయిడ్-వంటి ఫైబ్రిల్ మరియు హైడ్రోజెల్ నిర్మాణం యొక్క నవల అంశాలతో పాటు, ఈ దృగ్విషయం బయోటెక్నాలజికల్ మరియు బయోమెడికల్ అప్లికేషన్‌లను కలిగి ఉండవచ్చని కూడా మేము చూపిస్తాము (Fig. 8).భావనకు రుజువుగా, మేము NTని GFP లేదా PNPతో కలిపి, ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ కూడా 37 °C వద్ద పొదిగినప్పుడు హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరుస్తుందని మరియు GFP మరియు PNP భిన్నాలు ఎక్కువగా జిలేషన్ తర్వాత వాటి కార్యాచరణను నిలుపుకుంటాయని చూపించాము (మూర్తి 6).న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్‌లు న్యూక్లియోసైడ్ అనలాగ్‌ల యొక్క ముఖ్యమైన ఉత్ప్రేరకాలు సంశ్లేషణ, ఇది బయోఫార్మాస్యూటికల్ పరిశ్రమకు సంబంధించిన మా ఆవిష్కరణను చేస్తుంది.అనుకూల పరిస్థితులలో పారదర్శక హైడ్రోజెల్‌లను ఏర్పరిచే ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లను వ్యక్తీకరించే భావన ఎంజైమ్ ఇమ్మొబిలైజేషన్, నియంత్రిత ఔషధ విడుదల మరియు కణజాల ఇంజనీరింగ్ వంటి విస్తృత శ్రేణి అనువర్తనాల కోసం అనుకూలమైన లక్షణాలతో ఫంక్షనలైజ్డ్ హైడ్రోజెల్‌లను సృష్టించడానికి అనుమతిస్తుంది.అదనంగా, NT మరియు NT* సమర్థవంతమైన వ్యక్తీకరణ గుర్తులు30, అంటే NT మరియు దాని వైవిధ్యాలు కరిగే ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క అధిక-నిర్గమాంశ ఉత్పత్తికి మరియు 3D హైడ్రోజెల్స్‌లో స్థిరీకరించబడిన లక్ష్య ప్రోటీన్‌ల తదుపరి సృష్టికి ఉపయోగించబడతాయి.
NT కరిగేది, α-హెలికల్ మరియు తక్కువ సాంద్రతలు (µM) మరియు 37°C వద్ద స్థిరంగా ఉంటుంది.అదే ఉష్ణోగ్రత వద్ద, కానీ పెరుగుతున్న సాంద్రతలలో (>10 mg/ml), NT అమిలాయిడ్ లాంటి ఫైబ్రిల్స్‌తో కూడిన జెల్‌లను ఏర్పరుస్తుంది.NT ఫ్యూజన్ ప్రొటీన్‌లు పూర్తి ఫంక్షనల్ ఫ్యూజన్ శకలాలు కలిగిన ఫైబ్రిల్లర్ జెల్‌లను కూడా ఏర్పరుస్తాయి, ఇది NT ఉపయోగించి 3D హైడ్రోజెల్స్‌లో వివిధ ప్రోటీన్‌లను స్థిరీకరించడానికి అనుమతిస్తుంది.దిగువ: NT (PDB: 4FBS) మరియు ఫైబర్ నెట్‌వర్క్‌లు మరియు అనుబంధిత ప్రోటీన్ నిర్మాణాల దృష్టాంతాలు (స్కేల్‌కు డ్రా అయినట్లు మరియు GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.224RJ/10.221b).
నిర్మాణాలు (అమినో యాసిడ్ సీక్వెన్స్‌లతో సహా పూర్తి జాబితా కోసం అనుబంధ పట్టిక 4ను చూడండి) ప్లాస్మిడ్ pT7లోకి క్లోన్ చేయబడింది మరియు E. coli BL21 (DE3)గా రూపాంతరం చెందింది.ఇంజనీర్డ్ ప్లాస్మిడ్‌లను కలిగి ఉన్న E. కోలి కనామైసిన్ (70 mg/l)తో అనుబంధంగా ఉన్న లూరియా రసంలో టీకాలు వేయబడింది మరియు రాత్రిపూట 30 ° C మరియు 250 rpm వద్ద పెంచబడింది.కనామైసిన్ కలిగిన LB మాధ్యమంలోకి కల్చర్ 1/100 టీకాలు వేయబడింది మరియు OD600 0.8కి చేరుకునే వరకు 30°C మరియు 110 rpm వద్ద కల్చర్ చేయబడింది.NMR అధ్యయనాల కోసం, ఐసోటోప్‌లతో ప్రోటీన్ లేబులింగ్ కోసం 2 గ్రా D-గ్లూకోజ్ 13C (ఆల్డ్రిచ్) మరియు 1 గ్రా అమ్మోనియం క్లోరైడ్ 15N (కేంబ్రిడ్జ్ ఐసోటోప్ లాబొరేటరీస్, ఇంక్.) కలిగిన M9 కనిష్ట మాధ్యమంలో బ్యాక్టీరియాను పెంచారు.ఉష్ణోగ్రతను 20 డిగ్రీల సెల్సియస్‌కు తగ్గించండి మరియు 0.15 mM ఐసోప్రొపైల్థియోగాలాక్టోపైరనోసైడ్ (చివరి గాఢత)తో ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపించండి.రాత్రిపూట ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ తర్వాత, కణాలు 20 నిమిషాలకు 7278 × g, 4 ° C వద్ద పండించబడ్డాయి.సెల్ గుళికలు 20 mM Tris-HCl, pH 8లో మళ్లీ అమర్చబడ్డాయి మరియు తదుపరి ఉపయోగం వరకు స్తంభింపజేయబడ్డాయి.కరిగిన కణాలు 30 kPa వద్ద సెల్ డిస్‌రప్టర్ (TS సిరీస్ మెషీన్‌లు, కాన్‌స్టంట్ సిస్టమ్స్ లిమిటెడ్, ఇంగ్లాండ్) ఉపయోగించి లైస్ చేయబడ్డాయి.అప్పుడు లైసేట్‌లను 25,000 గ్రా వద్ద 4 ° C వద్ద 30 నిమిషాలు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేశారు.NTMiSp కోసం, పెల్లెట్‌ని 2 M యూరియా, 20 mM Tris-HCl, pH 8లో మళ్లీ అమర్చారు మరియు 2 నిమిషాలు (2 సె ఆన్/ఆఫ్, 65%) సోనికేట్ చేయబడింది, ఆపై మళ్లీ 25,000 xg, 4 ° C. లోపల సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది. 30 నిమి.సూపర్‌నాటెంట్ Ni-NTA కాలమ్‌లో లోడ్ చేయబడింది, 20 mM Tris-HCl, 2 mM ఇమిడాజోల్, pH 8తో కడిగివేయబడింది మరియు చివరకు ప్రోటీన్‌ను 20 mM Tris-HCl, 200 mM ఇమిడాజోల్, pH 8తో తొలగించారు. NT2RepCTని ఉత్పత్తి చేయడానికి మరియు NTCT, త్రాంబిన్ జీర్ణక్రియ అతని మరియు NT మధ్య సైట్ (ThrCleav) ను పరిచయం చేస్తుంది.అతని-NT-ThrCleav-2Rep (2Repని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), అతని-థియోరెడాక్సిన్-ThrCleav-NT (NTని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), హిస్-థియోరెడాక్సిన్-ThrCleav-CT (CTని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), హిస్-థియోరెడాక్సిన్-ThrCleav-లో కూడా థ్రాంబిన్ క్లీవేజ్ సైట్‌లు ఉన్నాయి. .* (NT*ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), హిస్-థియోరెడాక్సిన్-ThrCleav-NTA72R (NTA72Rని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), హిస్-థియోరెడాక్సిన్-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Spని ఉత్పత్తి చేస్తుంది), మరియు హిస్-సల్ఫర్ రెడాక్సిన్-ThrCleav-NTMiSpduce (NTA)నిర్మాణాలు త్రోంబిన్ (1:1000)తో జీర్ణం చేయబడ్డాయి మరియు 6-8 kDa పరమాణు బరువు థ్రెషోల్డ్‌తో స్పెక్ట్రా/పోర్ డయాలసిస్ మెమ్బ్రేన్‌ను ఉపయోగించి 20 mM Tris-HCl, pH 8తో 4° C. వద్ద రాత్రిపూట డయలైజ్ చేయబడ్డాయి.డయాలసిస్ తర్వాత, పరిష్కారం Ni-NTA కాలమ్‌లో లోడ్ చేయబడుతుంది మరియు ఆసక్తి ఉన్న ప్రోటీన్‌ను కలిగి ఉన్న వ్యర్థపదార్థం సేకరించబడుతుంది.తయారీదారుల ప్రోటోకాల్ ప్రకారం బ్రాడ్‌ఫోర్డ్ పరీక్షను ఉపయోగించే NTF1Sp మినహా, ప్రతి ప్రోటీన్ యొక్క విలుప్త గుణకం ఉపయోగించి 280 nm వద్ద UV శోషణను కొలవడం ద్వారా ప్రోటీన్ సాంద్రతలు నిర్ణయించబడతాయి.SDS పాలియాక్రిలమైడ్ (4-20%) జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ మరియు కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ స్టెయినింగ్ ద్వారా స్వచ్ఛత నిర్ణయించబడింది.20 నిమిషాల సైకిల్స్‌లో 10 kDa మాలిక్యులర్ వెయిట్ కటాఫ్‌తో 4000 xg వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ ఫిల్టర్‌లను (వివాస్పిన్ 20, GE హెల్త్‌కేర్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్‌లు కేంద్రీకరించబడ్డాయి.
ప్రోటీన్ ద్రావణాన్ని కరిగించి, 150 µlని 1 ml క్లియర్ సెప్టం సీసాలో (8 x 40 mm థర్మో సైంటిఫిక్) జాగ్రత్తగా పైప్ చేయండి.బాష్పీభవనాన్ని నిరోధించడానికి ట్యూబ్‌లు పారాఫిల్మ్‌తో కప్పబడి సీలు చేయబడ్డాయి.నమూనాలు (n = 3) 37 ° C లేదా 60 ° C వద్ద పొదిగేవి మరియు క్రమానుగతంగా జిలేషన్‌ను గమనించడానికి విలోమం చేయబడ్డాయి.జెల్ చేయని నమూనాలు కనీసం ఒక వారం పాటు పొదిగేవి.10 μM ప్రోటీన్‌కు 10 mM DTTతో NTMiSp డైసల్ఫైడ్ బంధాలను తగ్గించండి.సహజ స్పైడర్ సిల్క్ పూతలను విశ్లేషించడానికి, స్వీడిష్ బ్రిడ్జ్ స్పైడర్ కత్తిరించబడింది, 20 mM Tris-HCl బఫర్ pH 8 యొక్క 200 μlలో రెండు ప్రధాన యాంప్లేటెడ్ గ్రంధులను ఉంచారు మరియు పూత గ్రంధుల నుండి విడిపోయేలా కత్తిరించబడింది..గ్రంధుల యొక్క కంటెంట్‌లు బఫర్‌లో కరిగిపోతాయి, పొడి బరువును నిర్ణయించడానికి 50 µl (నిరంతర బరువుకు 60 °C వద్ద ఓపెన్ వైల్స్‌ను పొదిగించడం ద్వారా) మరియు 37 °C వద్ద జిలేషన్ కోసం 150 µl.
కొలిచే జ్యామితి/సాధనం 20 మిమీ ఎగువ వ్యాసం మరియు 0.5 మిమీ గ్యాప్‌తో సమాంతర ప్లేట్‌ను ఉపయోగించి స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్‌తో తయారు చేయబడింది.స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ బాటమ్ పెల్టియర్ ప్లేట్‌ని ఉపయోగించి నమూనాను నిమిషానికి 1 °C చొప్పున 25 °C నుండి 45 °C వరకు మరియు తిరిగి 25 °Cకి వేడి చేయండి.వైబ్రేషనల్ కొలతలు 0.1 Hz ఫ్రీక్వెన్సీలో మరియు 100 mg/mL మరియు 300-500 mg/mL నమూనాల కోసం వరుసగా 5% మరియు 0.5% స్ట్రెయిన్ వద్ద పదార్థం యొక్క లీనియర్ విస్కోలాస్టిక్ ప్రాంతంలో నిర్వహించబడ్డాయి.బాష్పీభవనాన్ని నిరోధించడానికి అనుకూల తేమ గదిని ఉపయోగించండి.ప్రిజం 9 ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషించబడింది.
800 నుండి 3900 cm–1 వరకు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద పరారుణ (IR) స్పెక్ట్రాను సేకరించడం కోసం.ATR పరికరం, అలాగే స్పెక్ట్రోమీటర్ ద్వారా కాంతి మార్గం, ప్రయోగానికి ముందు మరియు సమయంలో పొడి ఫిల్టర్ చేయబడిన గాలితో ప్రక్షాళన చేయబడుతుంది.పరిష్కారాలు (స్పెక్ట్రాలో నీటి శోషణ శిఖరాలను తగ్గించడానికి 500 mg/mL) స్ఫటికాలపై పైపెట్ చేయబడ్డాయి మరియు కొలతకు ముందు జెల్లు (500 mg/mL) ఏర్పడి, ఆపై స్ఫటికాలకు బదిలీ చేయబడ్డాయి (n = 3).1000 స్కాన్‌లు 2 cm-1 రిజల్యూషన్ మరియు 2 యొక్క జీరో డ్యూటీ సైకిల్‌తో రికార్డ్ చేయబడ్డాయి. రెండవ ఉత్పన్నం తొమ్మిది పాయింట్ల స్మూటింగ్ రేంజ్‌ని ఉపయోగించి OPUS (బ్రూకర్)ని ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది.ఎఫ్. మెంగెస్ "స్పెక్ట్రాగ్రిఫ్ - ఆప్టికల్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ సాఫ్ట్‌వేర్"ని ఉపయోగించి 1720 మరియు 1580 సెం.మీ-1 మధ్య అదే ఏకీకరణ ప్రాంతానికి స్పెక్ట్రా సాధారణీకరించబడింది.ATR-IR స్పెక్ట్రోస్కోపీలో, ఒక నమూనాలోకి ఇన్‌ఫ్రారెడ్ పుంజం యొక్క చొచ్చుకుపోయే లోతు తరంగ సంఖ్యపై ఆధారపడి ఉంటుంది, దీని ఫలితంగా అధిక తరంగ సంఖ్యల కంటే తక్కువ వేవ్‌నంబర్‌ల వద్ద బలమైన శోషణ ఉంటుంది.అంజీర్‌లో చూపిన స్పెక్ట్రా కోసం ఈ ప్రభావాలు సరిదిద్దబడలేదు.3 ఎందుకంటే అవి చాలా చిన్నవి (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4).Bruker OPUS సాఫ్ట్‌వేర్‌ని ఉపయోగించి ఈ సంఖ్య కోసం సరిదిద్దబడిన స్పెక్ట్రా లెక్కించబడింది.
సూత్రప్రాయంగా, అమైడ్ I పీక్‌లోని భాగాల విశ్వసనీయమైన డీకన్వల్యూషన్ తర్వాత ప్రోటీన్ కన్ఫర్మేషన్‌ల యొక్క సమగ్ర పరిమాణీకరణ సాధ్యమవుతుంది.అయితే ఆచరణలో కొన్ని అడ్డంకులు ఎదురవుతాయి.స్పెక్ట్రమ్‌లోని శబ్దం డీకాన్వల్యూషన్ సమయంలో (తప్పుడు) శిఖరాలుగా కనిపిస్తుంది.అదనంగా, నీరు వంగడం వల్ల వచ్చే శిఖరం అమైడ్ I శిఖరం యొక్క స్థానంతో సమానంగా ఉంటుంది మరియు ఇక్కడ అధ్యయనం చేసిన సజల జెల్ వంటి పెద్ద మొత్తంలో నీటిని కలిగి ఉన్న నమూనాల కోసం ఇదే పరిమాణం ఉండవచ్చు.అందువల్ల, మేము అమైడ్ I శిఖరాన్ని పూర్తిగా కుళ్ళిపోవడానికి ప్రయత్నించలేదు మరియు మా పరిశీలనలు NMR స్పెక్ట్రోస్కోపీ వంటి ఇతర పద్ధతులకు మద్దతుగా మాత్రమే పరిగణించబడతాయి.
50 mg/ml NT మరియు His-NT2RepCT యొక్క సొల్యూషన్‌లు రాత్రిపూట 37 ° C వద్ద జెల్ చేయబడ్డాయి.హైడ్రోజెల్‌ను 20 mM Tris-HCl (pH 8)తో 12.5 mg/ml సాంద్రతకు కరిగించి, బాగా కదిలించి, జెల్‌ను విచ్ఛిన్నం చేయడానికి పైపెట్ చేయబడింది.తరువాత, హైడ్రోజెల్ 20 mM Tris-HCl (pH 8) తో 10 సార్లు కరిగించబడుతుంది, 5 μl నమూనా ఫార్మ్‌వార్‌తో పూసిన రాగి గ్రిడ్‌కు వర్తించబడుతుంది మరియు అదనపు నమూనా బ్లాటింగ్ పేపర్‌తో తొలగించబడింది.నమూనాలను 5 µl మిల్లిక్యూ నీటితో రెండుసార్లు కడుగుతారు మరియు 1% యురేనిల్ ఫార్మేట్‌తో 5 నిమిషాల పాటు తడిపారు.శోషక కాగితంతో అదనపు మరకను తొలగించండి, ఆపై మెష్‌ను గాలిలో ఆరబెట్టండి.100 kV వద్ద పనిచేసే FEI Tecnai 12 Spirit BioTWINని ఉపయోగించి ఈ గ్రిడ్‌లపై ఇమేజింగ్ ప్రదర్శించబడింది.వెలెటా 2k × 2k CCD కెమెరా (ఒలింపస్ సాఫ్ట్ ఇమేజింగ్ సొల్యూషన్స్, GmbH, మున్‌స్టర్, జర్మనీ) ఉపయోగించి చిత్రాలు x 26,500 మరియు x 43,000 మాగ్నిఫికేషన్‌లలో రికార్డ్ చేయబడ్డాయి.ప్రతి నమూనా కోసం (n = 1), 10–15 చిత్రాలు రికార్డ్ చేయబడ్డాయి.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ఇమేజ్ విశ్లేషణ మరియు ఫైబర్ వ్యాసాల కొలత కోసం ఉపయోగించబడింది (n = 100, వివిధ ఫైబర్‌లు).ప్రిజం 9 జతచేయని t-పరీక్షలను (రెండు-తోక) నిర్వహించడానికి ఉపయోగించబడింది.సగటు అతని-NT2RepCT మరియు NT ఫైబ్రిల్స్ వరుసగా 11.43 (SD 2.035) మరియు 7.67 (SD 1.389) nm.విశ్వాస విరామం (95%) -4.246 నుండి -3.275.స్వేచ్ఛ యొక్క డిగ్రీలు = 198, p <0.0001.
కార్నింగ్ 96-వెల్ బ్లాక్ బాటమ్ క్లియర్ బాటమ్ ప్లేట్‌లను (కార్నింగ్ గ్లాస్ 3881, USA) ఉపయోగించి స్టాటిక్ పరిస్థితులలో 10 µM థియోఫ్లావిన్ T (ThT) కలిగిన 80 µl ద్రవ నమూనాలను త్రిపాది (n = 3)లో కొలుస్తారు.440 nm ఉత్తేజిత వడపోత మరియు 480 nm ఉద్గార వడపోత (BMG ల్యాబ్‌టెక్, ఆఫ్ఫెన్‌బర్గ్, జర్మనీ నుండి FLUOStar గెలాక్సీ) ఉపయోగించి ఫ్లోరోసెన్స్ తేడాలు నమోదు చేయబడ్డాయి.ThT సిగ్నల్ సంతృప్తమైనది లేదా చల్లార్చబడలేదు, ఎందుకంటే సిగ్నల్ తీవ్రతను మార్చకుండా ThT యొక్క వివిధ సాంద్రతలతో ప్రయోగాలు జరిగాయి.పొగమంచు కొలత కోసం 360 nm వద్ద శోషణను రికార్డ్ చేయండి.విత్తన ప్రయోగాల కోసం, 100 mg/mL జెల్‌లు 37° C. వద్ద ఏర్పడి, మళ్లీ సస్పెండ్ చేయబడి, 5%, 10% మరియు 20% మోలార్ నిష్పత్తిలో విత్తనాల కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి.ప్రిజం 9 ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషించబడింది.
మంచు మీద His-NT2RepCT మరియు NT >100 mg/mL నిల్వలను కరిగించి, 0.22 µm ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయండి.నానోడ్రాప్ ఉపయోగించి 280 nm వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా సాంద్రతలు లెక్కించబడ్డాయి.స్పష్టమైన దిగువన ఉన్న 96-బావి నల్లని నాన్-బైండింగ్ ప్లేట్ (కార్నింగ్) బావులలో, నమూనాలను 20 mM Tris-HCl pH 8లో 20 mg/mlకి కరిగించి, 5 μM ThT (చివరి గాఢత), మొత్తం నమూనా ఏకాగ్రతతో కలుపుతారు. 50 μl వాల్యూమ్.TTH ఇమేజింగ్ కోసం ప్రసారం చేయబడిన కాంతి ఛానెల్ మరియు FITC ఉత్తేజితం మరియు ఉద్గార వడపోత సెట్‌లతో సెల్‌అబ్‌సర్వర్ (జీస్) మైక్రోస్కోప్‌లో ప్రతి 10 నిమిషాలకు 37 °C వద్ద నమూనాలు చిత్రించబడతాయి.ఇమేజింగ్ కోసం 20x/0.4 లెన్స్ ఉపయోగించబడుతుంది.చిత్ర విశ్లేషణ కోసం జెన్ బ్లూ (జీస్) మరియు ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ఉపయోగించబడ్డాయి.20 mM Tris pH 8 మరియు 5 µM ThT కలిగి ఉన్న 50 mg/mL గాఢతతో NT మరియు His-NT2RepCT సొల్యూషన్‌ల నుండి కూడా జెల్లు తయారు చేయబడ్డాయి మరియు 90 నిమిషాల పాటు 37°C వద్ద పొదిగేవి.జెల్ ముక్కలు 20 mM Tris, pH 8 మరియు 5 μM ThT కలిగిన కొత్త బావికి నాన్-బైండింగ్ బ్లాక్ 96 బాగా క్లియర్ బాటమ్ ప్లేట్‌లో బదిలీ చేయబడ్డాయి.20x/0.4 మాగ్నిఫికేషన్ వద్ద ఆకుపచ్చ ఫ్లోరోసెన్స్ మరియు ప్రకాశవంతమైన ఫీల్డ్ ఇమేజ్‌లను పొందండి.ఇమేజ్ విశ్లేషణ కోసం ImageJ ఉపయోగించబడింది.
QCI క్వాడ్రూపోల్ రెసొనెన్స్ పల్సెడ్ గ్రేడియంట్ ఫీల్డ్ క్రియోప్రోబ్ (HFCN)తో కూడిన 600 MHz బ్రూకర్ అవాన్స్ నియో స్పెక్ట్రోమీటర్‌పై 310 K వద్ద సొల్యూషన్ NMR స్పెక్ట్రా పొందబడింది.20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1)లో 13C, 15Nతో లేబుల్ చేయబడిన 10 mg/mL సజాతీయ ప్రోటీన్ కలిగిన NMR నమూనాలు .15N-HSQC యొక్క 2D స్పెక్ట్రమ్‌లో పీక్ 23ని కేటాయించడానికి pH 6.7 వద్ద NT2RepCT యొక్క రసాయన మార్పులు ఉపయోగించబడ్డాయి.
మ్యాజిక్ యాంగిల్ స్పిన్నింగ్ సాలిడ్ NMR (MAS) స్పెక్ట్రా 13C, 15N-లేబుల్ చేయబడిన హైడ్రోజెల్‌లు 3.2 mm 13C/15N{1H} ఎలక్ట్రాన్‌లెస్ ప్రోబ్‌తో కూడిన 800 MHz వద్ద Bruker Avance III HD స్పెక్ట్రోమీటర్‌లో రికార్డ్ చేయబడ్డాయి.నమూనా ఉష్ణోగ్రత 277 K వద్ద వేరియబుల్ ఉష్ణోగ్రత గ్యాస్ స్ట్రీమ్‌ని ఉపయోగించి నియంత్రించబడుతుంది. టూ-డైమెన్షనల్ డైపోల్ రొటేషనల్ రెసొనెన్స్ (DARR)76 మరియు రేడియో ఫ్రీక్వెన్సీ రీకనెక్షన్ (RFDR)77 స్పెక్ట్రాలు వరుసగా 12.5 kHz మరియు 20 kHz MAS ఫ్రీక్వెన్సీల వద్ద పొందబడ్డాయి.1H నుండి 13C వరకు క్రాస్ పోలరైజేషన్ (CP) 1H వద్ద 60.0 నుండి 48.0 kHz వరకు, 61.3/71.6 kHz వద్ద 13C (12.5/20 kHz MAS వద్ద) మరియు సంప్రదింపు సమయం 0.5–1 ms వరకు ఒక లీనియర్ ర్యాంప్‌ని ఉపయోగించి ప్రదర్శించబడింది.డేటా సేకరణ సమయంలో 73.5 kHz వద్ద స్పైనల్6478 డీకప్లింగ్ ఉపయోగించబడింది.సముపార్జన సమయం 10 మిల్లీసెకన్లు మరియు చక్రం ఆలస్యం 2.5 సెకన్లు.RFDR స్పెక్ట్రాలో గమనించిన సింగిల్-లింక్డ్ Cα/Cβ సహసంబంధాలు DARR స్పెక్ట్రాలోని లక్షణ అవశేషాల-రకం రసాయన మార్పులు మరియు గుణకారం-లింక్డ్ సహసంబంధాల ఆధారంగా కేటాయించబడ్డాయి.
Zipper79 డేటాబేస్ (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp మరియు NTMiSp కోసం ఫ్లట్టర్ ధోరణులను మరియు రోసెట్టా శక్తిని అంచనా వేయడానికి ఉపయోగించబడింది.Zipper డేటాబేస్ Rosetta Energy80ని గణిస్తుంది, ఇది ప్రోటీన్ నిర్మాణాన్ని మోడల్ చేయడానికి మరియు విశ్లేషించడానికి అనేక ఉచిత శక్తి విధులను మిళితం చేస్తుంది.-23 కిలో కేలరీలు/మోల్ లేదా అంతకంటే తక్కువ శక్తి స్థాయి ఫైబ్రిలేట్‌కు అధిక ధోరణిని సూచిస్తుంది.తక్కువ శక్తి అంటే జిప్పర్ కన్ఫర్మేషన్‌లోని రెండు β-స్ట్రాండ్‌ల మరింత స్థిరత్వం.అదనంగా, NT, NTFlSp మరియు NTMiSp Refలలో అమిలోయిడోజెనిక్ ప్రాంతాలను అంచనా వేయడానికి వాల్ట్జ్ అల్గోరిథం ఉపయోగించబడింది.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT ప్రోటీన్ ద్రావణాన్ని pH 5.5 మరియు 6.0 వద్ద 2-(N-మోర్ఫోలినో) ఇథనేసల్ఫోనిక్ యాసిడ్ (MES) బఫర్‌తో కలిపి pHని వరుసగా pH 6 మరియు 7కి తగ్గించారు.చివరి ప్రోటీన్ సాంద్రత 100 mg/ml.
J-1500 CD స్పెక్ట్రోమీటర్ (JASCO, USA)లో 0.1 సెంటీమీటర్ల ఆప్టికల్ మార్గంతో 300 μL క్యూవెట్‌ని ఉపయోగించి కొలతలు నిర్వహించబడ్డాయి.20 mM ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 8)లో ప్రోటీన్లు 10 μM (n = 1) కు కరిగించబడ్డాయి.ఉప్పు సమక్షంలో ప్రోటీన్ స్థిరత్వాన్ని విశ్లేషించడానికి, ప్రోటీన్లు వరుసగా 154 mM NaF లేదా NaCl కలిగిన 20 mM ఫాస్ఫేట్ బఫర్ (pH 8)లో అదే ఏకాగ్రత (n = 1) వద్ద విశ్లేషించబడ్డాయి.ఉష్ణోగ్రత స్కాన్‌లు 222 nm వద్ద 25°C నుండి 95°C వరకు 1°C/నిమి వేడి రేటుతో నమోదు చేయబడ్డాయి.స్థానికంగా మడతపెట్టిన ప్రోటీన్ల నిష్పత్తి (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal) ఫార్ములా ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది.అదనంగా, ప్రతి నమూనాకు 260 nm నుండి 190 nm వరకు 25 ° C వద్ద మరియు 95 ° C వరకు వేడి చేసిన తర్వాత ఐదు స్పెక్ట్రాలు నమోదు చేయబడ్డాయి.ఐదు స్పెక్ట్రాలు సరాసరి, సున్నితంగా మరియు మోలార్ ఎలిప్టిసిటీకి మార్చబడ్డాయి.ప్రిజం 9 ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషించబడింది.
అతని-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత 96-బావి కార్నింగ్ ప్లేట్లలో స్థిరమైన పరిస్థితులలో నలుపు పారదర్శక దిగువ (కార్నింగ్ గ్లాస్ 3881, USA)తో మూడుసార్లు (n = 3) కొలుస్తారు.395 nm ఉత్తేజిత తరంగదైర్ఘ్యంతో ఫ్లోరోసెన్స్ ఆధారిత ప్లేట్ రీడర్‌తో నమూనాలను కొలవండి మరియు జిలేషన్‌కు ముందు 509 nm వద్ద మరియు 2 గంటల తర్వాత 37 ° C వద్ద ఉద్గారాన్ని రికార్డ్ చేయండి.ప్రిజం 9తో డేటా విశ్లేషించబడింది.
తయారీదారు సూచనల ప్రకారం ప్యూరిన్ న్యూక్లియోసైడ్ ఫాస్ఫోరైలేస్ యాక్టివిటీ అస్సే కిట్ (ఫ్లోరోమెట్రిక్ పద్ధతి, సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్) ఉపయోగించబడింది.అతని-NT-PNPని కలిగి ఉన్న జెల్‌లు మరియు సొల్యూషన్‌లలో కార్యాచరణను కొలవడానికి, 10 ng His-NT-PNPని 100 mg/mL NTతో కలిపి మొత్తం 2 µL వాల్యూమ్‌కు కలపండి, ఎందుకంటే జెల్ సెట్ యొక్క గుర్తింపు విరామం కంటే ఎక్కువ సిగ్నల్ ఇచ్చింది.అతని-NT-PNP లేకుండా జెల్లు మరియు పరిష్కారాల కోసం నియంత్రణలు చేర్చబడ్డాయి.కొలతలు రెండుసార్లు జరిగాయి (n = 2).కార్యాచరణను కొలిచిన తర్వాత, ప్రతిచర్య మిశ్రమం తొలగించబడింది మరియు కొలత సమయంలో జెల్ చెక్కుచెదరకుండా ఉండేలా జెల్ ఫోటో తీయబడింది.ప్రిజం 9 ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషించబడింది.
అధ్యయన రూపకల్పనపై మరింత సమాచారం కోసం, ఈ కథనానికి లింక్ చేయబడిన ప్రకృతి అధ్యయన సారాంశాన్ని చూడండి.
గణాంకాలు 1 మరియు 2 ప్రారంభ డేటాను ప్రదర్శిస్తాయి.1c, 2a-c, 3a, b, e-g, 4, 5b, d, f, మరియు 6, సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్.3, అనుబంధ అంజీర్.5a, d, అనుబంధ అంజీర్.6 మరియు అనుబంధ అంజీర్.8. ఈ అధ్యయనం నుండి డేటా డేటా Zenodo డేటాబేస్ https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653లో హోస్ట్ చేయబడింది.ఈ అధ్యయనంలో పొందిన NMR డేటా ఎంట్రీ ID bmrbig36 క్రింద BMRBig రిపోజిటరీకి పోస్ట్ చేయబడింది.GFP మరియు PNP యొక్క నిర్మాణాలు PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2) నుండి తీసుకోబడ్డాయి.
రైజింగ్, A. మరియు జోహన్సన్, J. స్పిన్నింగ్ కృత్రిమ స్పైడర్ సిల్క్.జాతీయ రసాయన.జీవశాస్త్రం.11, 309–315 (2015).
బాబ్, PL మరియు ఇతరులు.నెఫిలా క్లావిప్స్ జన్యువు స్పైడర్ సిల్క్ జన్యువుల వైవిధ్యాన్ని మరియు వాటి సంక్లిష్ట వ్యక్తీకరణను హైలైట్ చేస్తుంది.నేషనల్ జెనెట్.49, 895–903 (2017).