347.

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు పరిమిత CSS మద్దతుతో బ్రౌజర్ సంస్కరణను ఉపయోగిస్తున్నారు.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతాము.
స్లైడర్‌లు ఒక్కో స్లయిడ్‌కు మూడు కథనాలను చూపుతున్నాయి.స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి వెనుక మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ప్రతి స్లయిడ్ ద్వారా తరలించడానికి చివర ఉన్న స్లయిడ్ కంట్రోలర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.

347 స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ పైప్ స్పెసిఫికేషన్

347 12.7*1.24mm స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ కాయిల్డ్ గొట్టాలు

వెలుపలి వ్యాసం: 6.00 mm OD నుండి 914.4 mm OD వరకు, 24” NB వరకు పరిమాణాలు అందుబాటులో ఉన్నాయి ఎక్స్-స్టాక్, OD పరిమాణం స్టీల్ ట్యూబ్‌లు అందుబాటులో ఎక్స్-స్టాక్

SS 347 పైప్ మందం పరిధి: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, మొదలైనవి (0.5-12 మిమీ) లేదా నాన్-రెగ్యులర్ పరిమాణాన్ని అవసరమైన విధంగా రూపొందించాలి

రకం: SS 347 అతుకులు లేని పైపులు |SS 347 ERW పైప్స్ |SS 347 వెల్డెడ్ పైప్స్ |SS 347 ఫ్యాబ్రికేటెడ్ పైప్స్ |SS 347 CDW ట్యూబ్‌లు, LSAW పైప్స్ / సీమ్-వెల్డెడ్ / రీడ్రాన్

ఫారం: SS 347 రౌండ్ పైపులు/ ట్యూబ్‌లు, SS 347 స్క్వేర్ పైపులు/ ట్యూబ్‌లు, SS 347 దీర్ఘచతురస్రాకార పైపు/ ట్యూబ్‌లు, SS 347 కాయిల్డ్ ట్యూబ్‌లు, SS 347 “U” ఆకారం, SS 347 పాన్ కేక్ ట్యూబ్‌లు, Hydraulic 347

పొడవు: సింగిల్ రాండమ్, డబుల్ రాండమ్ & అవసరమైన పొడవు ముగింపు: ప్లెయిన్ ఎండ్, బెవెల్డ్ ఎండ్, ట్రెడెడ్

ఎండ్ ప్రొటెక్షన్: ప్లాస్టిక్ క్యాప్స్ |వెలుపలి ముగింపు: 2B, No.4, No.1, No.8 స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ పైపుల కోసం మిర్రర్ ఫినిష్, కస్టమర్ అవసరాల ప్రకారం పూర్తి చేయండి

డెలివరీ కండిషన్: ఎనియల్డ్ మరియు పిక్లింగ్, పాలిష్డ్, బ్రైట్ ఎనియల్డ్, కోల్డ్ డ్రా

తనిఖీ, పరీక్ష నివేదికలు: మిల్ టెస్ట్ సర్టిఫికెట్లు, EN 10204 3.1, రసాయన నివేదికలు, మెకానికల్ నివేదికలు, PMI పరీక్ష నివేదికలు, విజువల్ తనిఖీ నివేదికలు, థర్డ్ పార్టీ తనిఖీ నివేదికలు, NABL ఆమోదించిన ల్యాబ్ నివేదికలు, విధ్వంసక పరీక్ష నివేదిక, నాన్ డెస్ట్రక్టివ్ టెస్ట్ రిపోర్ట్‌లు

ప్యాకింగ్: చెక్క పెట్టెలు, ప్లాస్టిక్ సంచులు, స్టీల్ స్ట్రిప్స్ బండిల్‌లో ప్యాక్ చేయబడింది లేదా కస్టమర్ల అభ్యర్థనల ప్రకారం

ప్రత్యేకతలు: పైన కాకుండా ఇతర పరిమాణాలు మరియు స్పెసిఫికేషన్‌లను అభ్యర్థనపై తయారు చేయవచ్చు

SS 347 పైప్ సైజు పరిధి:1/2 అంగుళాల NB, OD నుండి 24 అంగుళాల వరకు

ASTM A312 347: అధిక ఉష్ణోగ్రత మరియు సాధారణ తినివేయు సేవ కోసం ఉద్దేశించిన అతుకులు మరియు స్ట్రెయిట్-సీమ్ వెల్డెడ్ ఆస్టెనిటిక్ పైపు.వెల్డింగ్ సమయంలో పూరక మెటల్ అనుమతించబడదు.

ASTM A358 347: తినివేయు మరియు/లేదా అధిక ఉష్ణోగ్రత సేవ కోసం ఎలక్ట్రిక్ ఫ్యూజన్ వెల్డెడ్ ఆస్టెనిటిక్ పైపు.సాధారణంగా ఈ స్పెసిఫికేషన్‌కు 8 అంగుళాల వరకు మాత్రమే పైప్ ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది.వెల్డింగ్ సమయంలో పూరక మెటల్ జోడించడం అనుమతించబడుతుంది.

ASTM A790 347: సీమ్‌లెస్ మరియు స్ట్రెయిట్-సీమ్ వెల్డెడ్ ఫెర్రిటిక్/ఆస్టెనిటిక్ (డ్యూప్లెక్స్) పైపు సాధారణ తినివేయు సేవ కోసం ఉద్దేశించబడింది, ఒత్తిడి తుప్పు పగుళ్లకు నిరోధకతపై ప్రత్యేక ప్రాధాన్యతనిస్తుంది.

ASTM A409 347: స్ట్రెయిట్-సీమ్ లేదా స్పైరల్-సీమ్ ఎలక్ట్రిక్ ఫ్యూజన్ 14" నుండి 30" పరిమాణాలలో వెల్డెడ్ పెద్ద వ్యాసం కలిగిన ఆస్టెనిటిక్ లైట్-వాల్ పైపుతో Sch5S మరియు Sch 10S గోడలతో తినివేయు మరియు/లేదా అధికం

ASTM A376 347: అధిక ఉష్ణోగ్రత అనువర్తనాల కోసం అతుకులు లేని ఆస్టెనిటిక్ పైపు.

ASTM A813 347: అధిక ఉష్ణోగ్రత మరియు సాధారణ తినివేయు అనువర్తనాల కోసం సింగిల్-సీమ్, సింగిల్- లేదా డబుల్-వెల్డెడ్ ఆస్టెనిటిక్ పైపు.

ASTM A814 347: అధిక ఉష్ణోగ్రత మరియు సాధారణ తినివేయు సేవ కోసం కోల్డ్-వర్క్డ్ వెల్డెడ్ ఆస్టెనిటిక్ పైప్.

347H స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ పైప్స్ కెమికల్ కంపోజిషన్

స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ 347H పైప్ మెకానికల్ ప్రాపర్టీస్

స్టెయిన్లెస్ స్టీల్ 347H పైప్స్ భౌతిక లక్షణాలు

347H స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ పైప్ కోసం సమానమైన గ్రేడ్‌లు

అమిలాయిడ్ ఆల్ఫా-సిన్యూక్లిన్ (αS) అగ్రిగేషన్ అనేది పార్కిన్సన్స్ వ్యాధి మరియు ఇతర సిన్యూక్లినోపతీల యొక్క ముఖ్య లక్షణం.ఇటీవల, అల్జీమర్స్ వ్యాధితో సాధారణంగా సంబంధం ఉన్న టౌ ప్రొటీన్ αS పాథాలజీతో సంబంధం కలిగి ఉంది మరియు αS- రిచ్ ఇన్‌క్లూషన్‌లలో సహ-స్థానికీకరించినట్లు కనుగొనబడింది, అయినప్పటికీ రెండు ప్రోటీన్ల కలయిక యొక్క పరమాణు విధానం అస్పష్టంగా ఉంది.టౌ వంటి ధనాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడిన పాలీపెప్టైడ్‌లతో ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్ కండెన్సేషన్ ద్వారా αS దశ ద్రవ ఘనీభవనాల్లోకి విడిపోతుందని మేము ఇక్కడ నివేదిస్తాము.పాలికేషన్‌ల కోసం αS యొక్క అనుబంధం మరియు గడ్డకట్టే నెట్‌వర్క్ యొక్క వాలెన్స్ క్షీణత రేటుపై ఆధారపడి, గడ్డకట్టడం వేగవంతమైన జిలేషన్ లేదా కోలెసెన్స్‌కు లోనవుతుంది, తర్వాత నెమ్మదిగా అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ జరుగుతుంది.అధునాతన బయోఫిజికల్ టెక్నిక్‌ల సూట్‌ను కలపడం ద్వారా, మేము ద్రవ-ద్రవ αS/Tau దశ విభజనను వర్గీకరించగలిగాము మరియు ద్రవ ప్రోటీన్ కండెన్సేట్‌లో రెండు ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉన్న విజాతీయ కంకరలు ఏర్పడటానికి దారితీసే ముఖ్య కారకాలను గుర్తించగలిగాము.
మెమ్బ్రేన్ కంపార్ట్‌మెంట్‌లతో పాటు, లిక్విడ్-లిక్విడ్ ఫేజ్ సెపరేషన్ (LLPS) అని పిలువబడే ప్రక్రియ ద్వారా, జీవఅణువుల కండెన్సేట్‌లు లేదా చుక్కలు అని పిలువబడే ప్రోటీన్-రిచ్, ద్రవ-వంటి దట్టమైన శరీరాలు ఏర్పడటం ద్వారా కణాలలో ప్రాదేశిక విభజనను కూడా సాధించవచ్చు.ఈ బిందువులు మల్టీవాలెంట్ టెంపోరల్ ఇంటరాక్షన్‌ల ద్వారా ఏర్పడతాయి, సాధారణంగా ప్రోటీన్లు లేదా ప్రోటీన్లు మరియు RNA మధ్య, మరియు దాదాపు అన్ని జీవన వ్యవస్థలలో వివిధ రకాల విధులను అందిస్తాయి.పెద్ద సంఖ్యలో LLP-సామర్థ్యం గల ప్రోటీన్‌లు తక్కువ సంక్లిష్టత యొక్క క్రమాలను ప్రదర్శిస్తాయి, ఇవి ప్రకృతిలో మరియు బయోమోలిక్యులర్ కండెన్సేట్‌ల నిర్మాణంలో అత్యంత అస్తవ్యస్తంగా ఉంటాయి3,4,5.అనేక ప్రయోగాత్మక అధ్యయనాలు ఈ ద్రవ-వంటి కండెన్సేట్‌లను తయారు చేసే ప్రోటీన్‌ల యొక్క సౌకర్యవంతమైన, తరచుగా అస్తవ్యస్తమైన మరియు మల్టీవాలెంట్ స్వభావాన్ని బహిర్గతం చేశాయి, అయితే ఈ ఘనీభవనాలను మరింత ఘన-వంటి పెరుగుదల మరియు పరిపక్వతను నియంత్రించే నిర్దిష్ట పరమాణు నిర్ణయాధికారుల గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు. రాష్ట్రం..
కొత్త డేటా అసహజమైన ప్రోటీన్-ఆధారిత LLPS మరియు బిందువులను ఘన నిర్మాణాలుగా మార్చడం అనేది సంబంధిత సెల్యులార్ మార్గాలు కావచ్చు, ఇవి కరగని విషపూరిత కంకరలు ఏర్పడటానికి దారితీస్తాయి, ఇవి తరచుగా క్షీణించిన వ్యాధుల యొక్క ముఖ్యాంశాలు.చాలా LLPS-అనుబంధ అంతర్గతంగా అస్తవ్యస్తమైన ప్రోటీన్లు (IDPలు), తరచుగా అధిక చార్జ్ మరియు ఫ్లెక్సిబుల్, అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ ప్రక్రియ ద్వారా చాలా కాలంగా న్యూరోడెజెనరేషన్‌తో సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి.ప్రత్యేకించి, FUS7 లేదా TDP-438 వంటి బయోమోలిక్యులర్ IDP కండెన్సేట్‌లు లేదా hnRNPA19 వంటి పెద్ద తక్కువ సంక్లిష్టత డొమైన్‌లు కలిగిన ప్రొటీన్‌లు ద్రవీకరణ అనే ప్రక్రియ ద్వారా జెల్-వంటి లేదా ఘన రూపాల్లోకి మారినట్లు చూపబడింది.సమ్మేళనం.సాలిడ్ ఫేజ్ ట్రాన్సిషన్ (LSPT)కి సమయం యొక్క విధిగా లేదా కొన్ని పోస్ట్-ట్రాన్స్‌లేషనల్ సవరణలు లేదా రోగలక్షణపరంగా ముఖ్యమైన ఉత్పరివర్తనలు1,7.
వివోలో ఎల్‌ఎల్‌పిఎస్‌తో అనుబంధించబడిన మరో ఐడిపి టౌ, ఇది మైక్రోటూబ్యూల్-అసోసియేటెడ్ డిజార్డర్డ్ ప్రొటీన్, దీని అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ అల్జీమర్స్ వ్యాధిలో చిక్కుకుంది10 కానీ ఇటీవల పార్కిన్సన్స్ వ్యాధి (పిడి) మరియు ఇతర సినాప్టిక్ న్యూక్లియర్ ప్రోటీనోపతీలు 11, 12, 13 సంబంధితంగా ఉన్నాయి.టౌ అనుకూలమైన ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యల కారణంగా ద్రావణం/సైటోప్లాజం నుండి ఆకస్మికంగా విడదీయబడుతుందని చూపబడింది, దీని ఫలితంగా ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్స్ అని పిలువబడే టౌ-సుసంపన్నమైన బిందువులు ఏర్పడతాయి.ఈ రకమైన నాన్-స్పెసిఫిక్ ఇంటరాక్షన్ ప్రకృతిలోని అనేక బయోమాలిక్యులర్ కండెన్సేట్‌ల వెనుక చోదక శక్తి అని కూడా గమనించబడింది.టౌ ప్రోటీన్ విషయంలో, ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ అగ్రిగేషన్ సాధారణ అగ్రిగేషన్ ద్వారా ఏర్పడుతుంది, దీనిలో ప్రోటీన్ యొక్క వ్యతిరేక చార్జ్ చేయబడిన ప్రాంతాలు క్లీవేజ్ ప్రక్రియను ప్రేరేపిస్తాయి లేదా RNA వంటి ప్రతికూలంగా ఛార్జ్ చేయబడిన పాలిమర్‌లతో పరస్పర చర్య ద్వారా సంక్లిష్టమైన అగ్రిగేషన్ ద్వారా ఏర్పడతాయి.
ఇటీవల, α- సిన్యూక్లిన్ (αS), PD మరియు ఇతర న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులలో సమిష్టిగా synucleinopathy17,18 అని పిలవబడే అమిలాయిడ్ IDP, సెల్యులార్ మరియు జంతు నమూనాలలో 19,20 ద్రవం-వంటి ప్రవర్తనతో ప్రోటీన్ కండెన్సేట్‌లలో కేంద్రీకృతమై ప్రదర్శించబడింది.ప్రధానంగా హైడ్రోఫోబిక్ పరస్పర చర్యల ద్వారా αS LLPSకి లోనవుతుందని ఇన్ విట్రో అధ్యయనాలు చూపించాయి, అయితే ఈ ప్రక్రియకు అనూహ్యంగా అధిక ప్రోటీన్ సాంద్రతలు మరియు విలక్షణంగా ఎక్కువ పొదిగే సమయాలు అవసరం.vivoలో గమనించిన αS-కలిగిన కండెన్సేట్‌లు దీని ద్వారా ఏర్పడతాయా లేదా ఇతర LLPS ప్రక్రియల ద్వారా ఏర్పడతాయా అనేది పరిష్కరించని కీలక సమస్యగా మిగిలిపోయింది.అదేవిధంగా, PD మరియు ఇతర సిన్యూక్లినోపతీలలోని న్యూరాన్‌లలో αS అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ గమనించబడినప్పటికీ, αS కణాంతర అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్‌కు లోనయ్యే ఖచ్చితమైన విధానం అస్పష్టంగానే ఉంది, ఎందుకంటే ఈ ప్రోటీన్ యొక్క అధిక ప్రసరణ ఈ ప్రక్రియను స్వయంగా ప్రేరేపించేలా కనిపించదు.అదనపు సెల్యులార్ డ్యామేజ్ తరచుగా అవసరమవుతుంది, ఇది కణాంతర αS అమిలాయిడ్ సమావేశాల పునఃన్యూక్లియేషన్ కోసం నిర్దిష్ట సెల్యులార్ స్థానాలు లేదా సూక్ష్మ పర్యావరణాలు అవసరమని సూచిస్తున్నాయి.ముఖ్యంగా అగ్రిగేషన్‌కు గురయ్యే ఒక సెల్యులార్ పర్యావరణం ప్రోటీన్ కండెన్సేట్‌ల లోపలి భాగం కావచ్చు 23 .
ఆసక్తికరంగా, పార్కిన్సన్స్ వ్యాధి మరియు ఇతర సిన్యూక్లినోపతీలు 24,25 ఉన్న మానవులలో లక్షణ వ్యాధి చేరికలలో αS మరియు టౌ సహ-స్థానికీకరించినట్లు కనుగొనబడ్డాయి మరియు ప్రయోగాలు రెండు ప్రోటీన్‌ల మధ్య సినర్జిస్టిక్ రోగలక్షణ సంబంధాన్ని నివేదించాయి 26,27 సంకలనం αS మరియు మధ్య సంభావ్య సంబంధాన్ని సూచిస్తున్నాయి. న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధులలో టౌ.రోగము.αS మరియు టౌ విట్రో మరియు వివో 28,29లో పరస్పరం సంకర్షణ చెందడం మరియు ప్రోత్సహించడం కనుగొనబడింది మరియు ఈ రెండు ప్రొటీన్‌లతో కూడిన విజాతీయ కంకరలు సిన్యూక్లినోపతీస్ 30 ఉన్న రోగుల మెదడుల్లో గమనించబడ్డాయి.ఏది ఏమైనప్పటికీ, αS మరియు టౌ మధ్య పరస్పర చర్య యొక్క పరమాణు ప్రాతిపదిక మరియు దాని సహ-సమూహం యొక్క విధానం గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.αS αS యొక్క అత్యంత ప్రతికూలంగా చార్జ్ చేయబడిన C-టెర్మినల్ ప్రాంతం మరియు టౌ యొక్క సెంట్రల్ ప్రోలైన్-రిచ్ ప్రాంతం మధ్య ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఆకర్షణ ద్వారా టౌతో సంకర్షణ చెందుతుందని నివేదించబడింది, ఇది ధనాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడిన అవశేషాలతో కూడా సమృద్ధిగా ఉంటుంది.
ఈ అధ్యయనంలో, పాలీ-ఎల్-లైసిన్ (పిఎల్‌కె) మరియు ఈ ప్రక్రియలో ఇతర ధనాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడిన పాలీపెప్టైడ్‌లతో పరస్పర చర్యకు భిన్నంగా, టౌ ప్రోటీన్ సమక్షంలో ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్ కండెన్సేషన్ ద్వారా αS బిందువులుగా విడదీయగలదని మేము చూపిస్తాము.αS చుక్కల నెట్‌వర్క్‌కు పరంజా అణువుగా పనిచేస్తుంది.ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ αS కోసర్వేట్‌ల పరిపక్వత ప్రక్రియలో గుర్తించదగిన వ్యత్యాసాలను మేము గుర్తించాము, ఇవి కోసర్‌వేట్ నెట్‌వర్క్‌లో పాల్గొన్న ప్రోటీన్ల పరస్పర చర్య యొక్క వేలెన్సీ మరియు శక్తిలో తేడాలతో సంబంధం కలిగి ఉంటాయి.ఆసక్తికరంగా, దీర్ఘకాల ద్రవ కోసర్వేట్‌లలో αS మరియు టౌ అమిలాయిడ్ ప్రోటీన్‌ల సహ-సమూహాన్ని మేము గమనించాము మరియు అటువంటి కోసర్‌వేట్‌లలో ఈ రెండు ప్రోటీన్‌ల సహ-సంకలనానికి దారితీసే కొన్ని ముఖ్య కారకాలను గుర్తించాము.ఇక్కడ మేము ఈ ప్రక్రియను వివరంగా వివరిస్తాము, ఇది వ్యాధి-నిర్దిష్ట చేరికలలో రెండు ప్రోటీన్ల కోలోకలైజేషన్ అంతర్లీనంగా ఉండే పరమాణు విధానం.
αS తటస్థ pH (Fig. 1a) వద్ద అధిక అయోనిక్ C-టెర్మినల్ టెయిల్‌ను కలిగి ఉంది మరియు ఇది పాలికేటినిక్ డిజార్డర్డ్ పాలీపెప్టైడ్ అణువులతో ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్‌ల సంక్షేపణం ద్వారా LLPSకి లోనవుతుందని మేము ఊహించాము.న్యూట్రల్ pH 32 వద్ద సానుకూలంగా చార్జ్ చేయబడిన మరియు అస్తవ్యస్తమైన పాలీమెరిక్ స్వభావం కారణంగా మేము 100-అవశేషాల పాలీ-L-లైసిన్ (pLK)ని ప్రారంభ నమూనా అణువుగా ఉపయోగించాము. ముందుగా, సొల్యూషన్ NMR స్పెక్ట్రోస్కోపీ ద్వారా pLK αS యొక్క Ct డొమైన్‌తో సంకర్షణ చెందుతుందని మేము ధృవీకరించాము. (Figure 1b) పెరుగుతున్న αS:pLK మోలార్ నిష్పత్తుల సమక్షంలో 13C/15N-లేబుల్ αSని ఉపయోగించడం.αS యొక్క Ct-డొమైన్‌తో pLK యొక్క పరస్పర చర్య రసాయన మార్పు యొక్క కదలికలలో మరియు ప్రోటీన్ యొక్క ఈ ప్రాంతంలో గరిష్ట తీవ్రతలో తగ్గుదలలో వ్యక్తమవుతుంది.ఆసక్తికరంగా, మేము సుమారుగా αS గాఢతతో pLKతో αSని కలిపినప్పుడు.5–25 µM పాలిథిలిన్ గ్లైకాల్ (5–15% PEG-8) సమక్షంలో (సాధారణ LLPS బఫర్: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) మేము వెంటనే ప్రోటీన్ ఏర్పడే విస్తృత క్షేత్రం ద్వారా వెళ్ళాము. .ఫ్లోరోసెన్స్ (WF) మరియు బ్రైట్-ఫీల్డ్ (BF) మైక్రోస్కోపీ (Fig. 1c) ఉపయోగించి చుక్కలు గమనించబడ్డాయి.సాంద్రీకృత αS (1 µM అలెక్సాఫ్లూర్488-లేబుల్ చేయబడిన αS, AF488-αS జోడించబడింది) కలిగిన 1-5 µm బిందువులు, వాటి ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ లక్షణాలు 10% 1,6-హెక్సానెడియోల్ (1,6-HD)కి వాటి నిరోధకత నుండి మరియు దాని యొక్క NaCl ఏకాగ్రతలో పెరుగుదల (Fig. 1c).αS/pLK ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్ యొక్క కోసర్వేట్‌ల యొక్క ద్రవం-వంటి స్వభావం మిల్లీసెకన్లలో (Fig. 1d) ఫ్యూజ్ చేయగల సామర్థ్యం ద్వారా ప్రదర్శించబడుతుంది.టర్బిడిమెట్రీని ఉపయోగించి, మేము ఈ పరిస్థితులలో బిందువుల ఏర్పాటును లెక్కించాము, దాని స్థిరత్వం (Fig. 1e)తో అనుబంధించబడిన ప్రధాన పరస్పర చర్య యొక్క ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ స్వభావాన్ని నిర్ధారించాము మరియు LLPS ప్రక్రియపై వివిధ పాలిమర్ నిష్పత్తుల ప్రభావాన్ని అంచనా వేసాము (Fig. 1f).అనేక రకాల పాలిమర్ నిష్పత్తులలో బిందువుల నిర్మాణం గమనించబడినప్పటికీ, pLK αS కంటే ఎక్కువగా ఉన్నప్పుడు ప్రక్రియ చాలా అనుకూలంగా ఉంటుంది.LLPలు రసాయనికంగా భిన్నమైన డిస్‌ప్లేసింగ్ ఏజెంట్ డెక్స్ట్రాన్-70 (70 kDa)ని ఉపయోగించడం లేదా గ్లాస్ స్లైడ్ డ్రాప్స్, వివిధ పదార్థాల మైక్రోప్లేట్ బావులు, ఎపెన్‌డార్ఫ్ లేదా క్వార్ట్జ్ కేశనాళికల వంటి వివిధ నమూనా ఫార్మాట్‌లను ఉపయోగించడం కూడా గమనించబడ్డాయి.
ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన WT-αS మరియు ΔCt-αS వేరియంట్‌లలోని వివిధ ప్రోటీన్ ప్రాంతాల యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం.యాంఫిపతిక్ N-టెర్మినల్ డొమైన్, హైడ్రోఫోబిక్ అమిలాయిడ్-ఫార్మింగ్ (NAC) ప్రాంతం మరియు ప్రతికూలంగా చార్జ్ చేయబడిన C-టెర్మినల్ డొమైన్ వరుసగా నీలం, నారింజ మరియు ఎరుపు రంగులలో చూపబడ్డాయి.WT-αS యొక్క నికర ఛార్జ్ పర్ రెసిడ్యువల్ (NCPR) మ్యాప్ చూపబడింది.b స్థూల కణ సమూహాలు లేనప్పుడు αS/pLK పరస్పర చర్య యొక్క NMR విశ్లేషణ.pLK ఏకాగ్రత పెరిగేకొద్దీ (αS:pLK మోలార్ నిష్పత్తులు 1:0.5, 1:1.5, మరియు 1:10 వరుసగా లేత ఆకుపచ్చ, ఆకుపచ్చ మరియు ముదురు ఆకుపచ్చ రంగులలో చూపబడతాయి).c Coacervate αS/pLK (మోలార్ నిష్పత్తి 1:10) వద్ద 25 µM (1 µM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS లేదా WF ఇమేజింగ్ కోసం Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన pLK) LLPS బఫర్‌లో (పైభాగంలో) లేదా NaCl (500 mm తర్వాత ఎడమ Cl) % 1,6-హెక్సానెడియోల్ (1,6-HD; కుడి దిగువ).స్కేల్ బార్ = 20 µm.d 25 μM గాఢత వద్ద αS/pLK (మోలార్ నిష్పత్తి 1:10) యొక్క BF బిందువుల కలయిక యొక్క ప్రతినిధి మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రాలు;బాణాలు వ్యక్తిగత చుక్కలను (ఎరుపు మరియు పసుపు బాణాలు) 200 ms లోపు కొత్త డ్రాప్ (నారింజ బాణం)గా విలీనం చేయడాన్ని సూచిస్తాయి) .స్కేల్ బార్ = 20 µm.e లైట్ స్కాటరింగ్ (350 nm వద్ద) 25 µM αS వద్ద 500 mM NaCl లేదా 10% 1,6-HD చేరికకు ముందు మరియు తర్వాత LLPS బఫర్‌లో αS/pLK అగ్రిగేషన్ (N = 3 నమూనా ప్రతిరూపాలు, సగటు మరియు ప్రామాణిక విచలనం కూడా సూచించబడుతుంది).పెరుగుతున్న αS:pLK మోలార్ నిష్పత్తి (N = 3 నమూనా ప్రతిరూపాలు, సగటు మరియు ప్రామాణిక విచలనం కూడా సూచించబడ్డాయి) 25 μM αS వద్ద αS/pLK అగ్రిగేషన్ యొక్క f BF ఇమేజ్ (టాప్) మరియు లైట్ స్కాటరింగ్ విశ్లేషణ (350 nm వద్ద, దిగువన).స్కేల్ బార్ = 10 µm.ఒక చిత్రంపై ఉన్న స్కేల్ బార్ ఒక ప్యానెల్‌లోని అన్ని చిత్రాల స్కేల్‌ను సూచిస్తుంది.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
αS/pLK ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్ కండెన్సేషన్ మరియు tau31తో ప్రత్యక్ష పరస్పర చర్య ద్వారా tau/RNA కండెన్సేట్ యొక్క క్లయింట్ మాలిక్యూల్‌గా αS యొక్క మునుపటి పరిశీలనల ఆధారంగా, RNA లేనప్పుడు αS మరియు tau ద్రావకంతో సహ-విభజన చేయవచ్చని మేము ఊహించాము. సంక్షేపణం.ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కాంప్లెక్స్‌ల ద్వారా, మరియు αS అనేది αS/Tau కోసర్వేట్స్‌లోని పరంజా ప్రోటీన్ (చిత్రం 2eలో టౌ ఛార్జ్ పంపిణీని చూడండి).LLPS బఫర్‌లో 10 μM αS మరియు 10 μM Tau441 (వరుసగా 1 μM AF488-αS మరియు 1 μM Atto647N-Tau) కలిపినప్పుడు, అవి WF మైక్రోస్కోపీ ద్వారా చూసినట్లుగా రెండు ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉన్న ప్రోటీన్ కంకరలను సులభంగా ఏర్పరుస్తాయని మేము గమనించాము.(Fig. 2a).బిందువులలోని రెండు ప్రోటీన్ల కోలోకలైజేషన్ కన్ఫోకల్ (CF) మైక్రోస్కోపీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1a) ద్వారా నిర్ధారించబడింది.డెక్స్ట్రాన్-70ని అగ్రిగేషన్ ఏజెంట్‌గా ఉపయోగించినప్పుడు ఇలాంటి ప్రవర్తన గమనించబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1 సి).FITC-లేబుల్ చేయబడిన PEG లేదా డెక్స్ట్రాన్‌ను ఉపయోగించి, క్రౌడింగ్ ఏజెంట్‌లు రెండూ నమూనాల అంతటా సమానంగా పంపిణీ చేయబడతాయని మేము కనుగొన్నాము, విభజన లేదా అనుబంధాన్ని చూపడం లేదు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1d).బదులుగా, ఈ వ్యవస్థలో వారు స్థూల కణ క్రౌడింగ్ ఎఫెక్ట్‌ల ద్వారా దశల విభజనను ప్రోత్సహిస్తారని ఇది సూచిస్తుంది, ఎందుకంటే PEG అనేది ఇతర LLP సిస్టమ్‌లలో కనిపించే విధంగా, ప్రాధాన్యపరంగా స్థిరమైన క్రౌడింగ్ ఏజెంట్.ఈ ప్రోటీన్-రిచ్ చుక్కలు NaCl (1 M)కి సున్నితంగా ఉంటాయి కానీ 1,6-HD (10% v/v)కి కాదు, వాటి ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ లక్షణాలను నిర్ధారిస్తుంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2a, b).BF మైక్రోస్కోపీ (Fig. 2b) ఉపయోగించి మిల్లీసెకన్ల విలీన బిందువుల సంఘటనలను గమనించడం ద్వారా వారి ద్రవ ప్రవర్తన నిర్ధారించబడింది.
LLPS బఫర్‌లో αS/Tau441 కోసర్వేట్‌ల యొక్క కన్ఫోకల్ (CF) మైక్రోస్కోపీ చిత్రాలు (ప్రతి ప్రోటీన్‌లో 10 μM, AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS యొక్క 0.5 μM మరియు Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441).b αS/Tau441 చుక్కల కలయిక సంఘటనల (ప్రతి ప్రోటీన్‌కి 10 μM) యొక్క ప్రతినిధి అవకలన జోక్యం కాంట్రాస్ట్ (DIC) చిత్రాలు.c 50 µM αS లేకపోవడం (ఎడమ) లేదా ఉనికి (కుడి)లో Tau441 LLPS (0–15 µM) కాంతి విక్షేపణం (350 nm వద్ద) ఆధారంగా దశ రేఖాచిత్రం.వెచ్చని రంగులు మరింత వికీర్ణాన్ని సూచిస్తాయి.d పెరుగుతున్న αS గాఢతతో αS/Tau441 LLPS నమూనాల కాంతి విక్షేపం (Tau441 వద్ద 5 µM, N = 2-3 నమూనా పునరావృత్తులు సూచించినట్లు).ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన కొన్ని టౌ ప్రోటీన్ వైవిధ్యాలు మరియు ప్రోటీన్ యొక్క వివిధ ప్రాంతాల యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం: ప్రతికూలంగా ఛార్జ్ చేయబడిన N- టెర్మినల్ డొమైన్ (ఎరుపు), ప్రోలైన్-రిచ్ ప్రాంతం (నీలం), మైక్రోటూబ్యూల్-బైండింగ్ డొమైన్ (MTBD, నారింజ రంగులో హైలైట్ చేయబడింది) మరియు అమిలాయిడ్-ఏర్పడే జంట మురి.MTBD (బూడిద) లోపల ఉన్న ఫిలమెంట్ ప్రాంతాలు (PHF).Tau441 యొక్క నికర ఛార్జ్ పర్ రెసిడ్యూ (NCPR) మ్యాప్ చూపబడింది.f 1 µM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన ΔNt-ని ఉపయోగించడం, ΔNt-Tau సమక్షంలో 1 µM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS లేదా ΔCt-αS (ప్రోటీన్‌కు 10 µ8 ప్రతి ప్రోటీన్) లేదా KM µ5 ) ) LLPS లేదా K18 బఫర్‌లో ఘనీభవించిన WF మైక్రోగ్రాఫ్‌లు.ఒక ఇమేజ్‌లోని స్కేల్ బార్‌లు ఒక ప్యానెల్‌లోని అన్ని ఇమేజ్‌ల స్కేల్‌ను సూచిస్తాయి (ప్యానెల్‌లకు 20 μm a, b మరియు f).c మరియు d ప్యానెల్‌ల కోసం ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌లుగా అందించబడుతుంది.
ఈ LLPS ప్రక్రియలో αS పాత్రను పరీక్షించడానికి, మేము ముందుగా NaCl (Fig. 2c) యొక్క పెరుగుతున్న సాంద్రతలను ఉపయోగించి నెఫెలోమెట్రీ ద్వారా బిందువుల స్థిరత్వంపై αS ప్రభావాన్ని పరిశోధించాము.αS కలిగి ఉన్న నమూనాలలో ఉప్పు సాంద్రత ఎక్కువ, కాంతి విక్షేపణ విలువలు (350 nm వద్ద) ఎక్కువగా ఉంటాయి, ఇది ఈ LLPS వ్యవస్థలో αS యొక్క స్థిరీకరణ పాత్రను సూచిస్తుంది.αS గాఢతను (అందుకే αS:Tau441 నిష్పత్తి) సుమారుగా పెంచడం ద్వారా ఇదే విధమైన ప్రభావాన్ని గమనించవచ్చు.టౌ ఏకాగ్రత (5 µM)కి సంబంధించి 10 రెట్లు పెరుగుదల (Fig. 2d).కోసర్వేట్‌లలో αS ఒక పరంజా ప్రోటీన్ అని నిరూపించడానికి, మేము LLPS-అంతరాయం కలిగించిన టౌ ఉత్పరివర్తన యొక్క ప్రవర్తనను పరిశోధించాలని నిర్ణయించుకున్నాము, ఇందులో ప్రతికూలంగా ఛార్జ్ చేయబడిన N-టెర్మినల్ ప్రాంతం (అవశేషాలు 1-150, Fig. 2e చూడండి) ΔNt-Tau అని పిలుస్తారు.WF మైక్రోస్కోపీ మరియు నెఫెలోమెట్రీ ΔNt-Tau స్వయంగా LLPS (Fig. 2f మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2d) చేయించుకోలేదని నిర్ధారించింది 14. అయితే, ఈ కత్తిరించబడిన టౌ వేరియంట్ యొక్క డిస్పర్షన్ సొల్యూషన్‌లకు αS జోడించబడినప్పుడు, LLPS ప్రక్రియ పూర్తిగా జరిగింది. సారూప్య పరిస్థితులు మరియు ప్రోటీన్ సాంద్రతలలో టౌ మరియు αS యొక్క పూర్తి-పరిమాణ ద్రావణాల బిందు సాంద్రతకు దగ్గరగా బిందు సాంద్రతతో పునరుద్ధరించబడింది.ఈ ప్రక్రియను తక్కువ స్థూల కణ రద్దీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2 సి) పరిస్థితులలో కూడా గమనించవచ్చు.LLPS ప్రక్రియలో C-టెర్మినల్ αS ప్రాంతం యొక్క పాత్ర, కానీ దాని మొత్తం పొడవు కాదు, (ΔCt- యొక్క అవశేషాలు 104-140 (Fig. 1a) లేని సి-టెర్మినల్ కత్తిరించబడిన αS వేరియంట్‌ను ఉపయోగించి బిందువుల నిర్మాణాన్ని నిరోధించడం ద్వారా ప్రదర్శించబడింది. αS) ప్రోటీన్ (Fig. 2f మరియు అనుబంధ Fig. 2d).αS మరియు ΔNt-Tau యొక్క కోలోకలైజేషన్ కన్ఫోకల్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 1b) ద్వారా నిర్ధారించబడింది.
Tau441 మరియు αS మధ్య LLPS మెకానిజమ్‌ను మరింత పరీక్షించడానికి, అదనపు టౌ వేరియంట్ ఉపయోగించబడింది, అవి మైక్రోటూబ్యూల్-బైండింగ్ డొమైన్ (MTBD)లో జత చేసిన హెలికల్ ఫిలమెంట్ కోర్ (PHF) ఫ్రాగ్‌మెంట్, ఇది నాలుగు లక్షణ రిపీట్ డొమైన్‌లను కలిగి ఉంటే, సాధారణంగా కూడా పిలుస్తారు. K18 శకలంగా (Fig. 2e చూడండి).మైక్రోటూబ్యూల్-బైండింగ్ డొమైన్‌కు ముందు ఉండే క్రమంలో ప్రోలైన్-రిచ్ డొమైన్‌లో ఉన్న టౌ ప్రోటీన్‌తో αS ప్రాధాన్యతనిస్తుందని ఇటీవల నివేదించబడింది.అయినప్పటికీ, PHF ప్రాంతం ధనాత్మకంగా చార్జ్ చేయబడిన అవశేషాలతో కూడా సమృద్ధిగా ఉంది (మూర్తి 2e చూడండి), ముఖ్యంగా లైసిన్ (15% అవశేషాలు), ఈ ప్రాంతం కూడా αS/Tau కాంప్లెక్స్ యొక్క సంక్షేపణకు దోహదం చేస్తుందో లేదో పరీక్షించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది.పరీక్షించిన పరిస్థితులలో (15% PEG లేదా 20% డెక్స్ట్రాన్‌తో LLPS బఫర్) (Figure 2f) K18 మాత్రమే 100 μM వరకు LLPSని ట్రిగ్గర్ చేయలేదని మేము గమనించాము.అయినప్పటికీ, మేము 50 µM αS నుండి 50 µM K18కి జోడించినప్పుడు, K18 మరియు αS కలిగిన ప్రోటీన్ బిందువులు వేగంగా ఏర్పడటం నెఫెలోమెట్రీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 2d) మరియు WF మైక్రోస్కోపీ (Fig. 2f) ద్వారా గమనించబడింది.ఊహించినట్లుగా, ΔCt-αS K18 యొక్క LLPS ప్రవర్తనను పునరుద్ధరించలేకపోయింది (Fig. 2f).αS/ΔNt-Tau లేదా αS/Tau441తో పోలిస్తే LLPSని ప్రేరేపించడానికి αS/K18 అగ్రిగేషన్‌కు కొంచెం ఎక్కువ ప్రోటీన్ సాంద్రతలు అవసరమని మేము గమనించాము, ఇతర అంశాలు సమానంగా ఉంటాయి.ఇది గతంలో వివరించిన విధంగా మైక్రోటూబ్యూల్-బైండింగ్ డొమైన్‌తో పోలిస్తే ప్రోలైన్-రిచ్ టౌ డొమైన్‌తో αS C-టెర్మినల్ ప్రాంతం యొక్క బలమైన పరస్పర చర్యకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.
αS లేనప్పుడు ΔNt-Tau LLPSని నిర్వహించలేనందున, పూర్తి-నిడివి గల Tau (ఐసోటైప్, Tau441/Tau441)తో LLPS సిస్టమ్‌లలో దాని సరళతను బట్టి αS/Tau LLPSని వర్గీకరించడానికి మేము ఈ Tau వేరియంట్‌ని ఎంచుకున్నాము.సంక్లిష్ట (హెటెరోటైపిక్, αS/Tau441) అగ్రిగేషన్ ప్రక్రియలతో.మేము సెంట్రిఫ్యూగేషన్ మరియు చెదరగొట్టబడిన దశ SDS-PAGE విశ్లేషణ (2e చూడండి) ద్వారా αS/Tau మరియు αS/ΔNt-Tau సిస్టమ్‌లలోని αS అగ్రిగేషన్ స్థాయిని (కన్డెన్స్డ్ ఫేజ్ ప్రోటీన్‌లో భాగంగా, fαS,c) పోల్చాము (2e చూడండి), చాలా సారూప్యమైన విలువలు కనుగొనబడ్డాయి. ఒకే ఏకాగ్రతతో అన్ని ప్రోటీన్లకు.ప్రత్యేకించి, మేము వరుసగా αS/Tau మరియు αS/ΔNt-Tau కోసం fαS,c 84 ± 2% మరియు 79 ± 7%ని పొందాము, αS మరియు tau మధ్య హెటెరోటైపిక్ ఇంటరాక్షన్ టౌ అణువుల మధ్య పరస్పర చర్య కంటే గొప్పదని సూచిస్తుంది.మధ్య.
ఫోటోబ్లీచింగ్ (FRAP) పద్ధతి తర్వాత ఫ్లోరోసెన్స్ రికవరీ ద్వారా వివిధ పాలికేషన్‌లతో పరస్పర చర్య మరియు αS గతిశాస్త్రంపై సంక్షేపణ ప్రక్రియ యొక్క ప్రభావం మొదట అధ్యయనం చేయబడింది.మేము αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau మరియు αS/pLK కోసర్వేట్‌లను పరీక్షించాము (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS మరియు 100 μM Tau441 లేదా ΔNt-TauKతో అనుబంధించబడింది).నమూనా భాగాలను కలిపిన తర్వాత మొదటి 30 నిమిషాల్లో డేటా పొందబడింది.ప్రతినిధి FRAP చిత్రాల నుండి (Fig. 3a, αS/Tau441 సంగ్రహణ) మరియు వాటి సంబంధిత సమయ కోర్సు వక్రతలు (Fig. 3b, అనుబంధ Fig. 3), αS గతిశాస్త్రం Tau441 కోసర్వేట్‌ల మాదిరిగానే ఉన్నట్లు చూడవచ్చు.మరియు ΔNt-Tau, ఇది pLKతో చాలా వేగంగా ఉంటుంది.FRAP ప్రకారం కోసర్వేట్ లోపల αS కోసం లెక్కించిన వ్యాప్తి గుణకాలు (కాంగ్ మరియు ఇతరులు 35 వివరించినట్లు) D = 0.013 ± 0.009 µm2/s మరియు D = 0.026 ± 0.008 µm2/s కోసం αS/Tau-44 αS/ వ్యవస్థ.pLK, Tau మరియు D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, వరుసగా (Fig. 3c).ఏది ఏమైనప్పటికీ, చెదరగొట్టబడిన దశలో వ్యాప్తి గుణకం αS అనేది అన్ని ఘనీభవించిన దశల కంటే ఎక్కువ పరిమాణంలో ఉంటుంది, ఫ్లోరోసెన్స్ కోరిలేషన్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (FCS, సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 3 చూడండి) అదే పరిస్థితులలో (LLPS బఫర్) కానీ పాలికేషన్లు లేనప్పుడు నిర్ణయించబడుతుంది. (D = 8 ± 4 µm2/s).అందువల్ల, ఉచ్చారణ పరమాణు రద్దీ ప్రభావాల కారణంగా చెదరగొట్టబడిన దశలో ప్రోటీన్‌లతో పోలిస్తే కోసర్వేట్‌లలో αS అనువాదం యొక్క గతిశాస్త్రం గణనీయంగా తగ్గింది, అయినప్పటికీ అన్ని కోసర్వేట్‌లు ఏర్పడిన తర్వాత మొదటి అరగంటలో ద్రవ-వంటి లక్షణాలను కలిగి ఉంటాయి, టౌ దశకు భిన్నంగా.pLK కండెన్సేట్‌లో వేగవంతమైన గతిశాస్త్రం.
ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్స్‌లో αS డైనమిక్స్ (2% AF488-లేబుల్ αS) యొక్క a–c FRAP విశ్లేషణ.ట్రిప్లికేట్‌లో αS/Tau441 FRAP పరీక్షల యొక్క ప్రాతినిధ్య చిత్రాలు (a)లో చూపబడ్డాయి, ఇక్కడ ఎరుపు వృత్తాలు రంగు మార్చబడిన ప్రాంతాలను సూచిస్తాయి.స్కేల్ బార్ 5 µm.b సగటు FRAP వక్రతలు మరియు (c) 100 µM αS మరియు Tau441 (ఎరుపు) లేదా ΔNt-Tau (నీలం) లేదా pLK (ఆకుపచ్చ) యొక్క ఈక్విమోలార్ సాంద్రతలను ఉపయోగించి మూడు ప్రయోగాల నుండి 5–6 (N) వేర్వేరు చుక్కల కోసం లెక్కించిన వ్యాప్తి గుణకాలు (D) LLPS సాంద్రత కంటే పది రెట్లు ఎక్కువ.FRAP వక్రరేఖ యొక్క ప్రామాణిక విచలనం షేడెడ్ రంగులో చూపబడింది.పోలిక కోసం, ఫ్లోరోసెన్స్ కోరిలేషన్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (FCS)ని ఉపయోగించి చెదరగొట్టబడిన దశలో వ్యాప్తి గుణకం αS మూడుసార్లు నిర్ణయించబడింది (మరింత సమాచారం కోసం అనుబంధ మూర్తి 3 మరియు పద్ధతులను చూడండి).d LLPS బఫర్‌లో 100 μM TEMPOL-122-αS యొక్క నిరంతర X-బ్యాండ్ EPR స్పెక్ట్రా ఎటువంటి పాలికేషన్ (నలుపు) లేకుండా లేదా 100 μM Tau441 (ఎరుపు) లేదా ΔNt-Tau (నీలం) లేదా 1 mM pLK (ఆకుపచ్చ) సమక్షంలో.ఇన్సెట్ అత్యంత నాటకీయ మార్పులు సంభవించే బలమైన ఫీల్డ్ లైన్ల యొక్క పెద్ద వీక్షణను చూపుతుంది.50 μM TEMPOL-122-αS బైండింగ్ వక్రతలు LLPS లేనప్పుడు వివిధ పాలీకేషన్‌లతో ఉంటాయి (PEG లేదు).సాధారణీకరించిన EPR స్పెక్ట్రమ్ యొక్క బ్యాండ్ II (IIII/III)తో పోలిస్తే బ్యాండ్ III యొక్క తగ్గిన వ్యాప్తి Tau441 (ఎరుపు), ΔNt-Tau (నీలం) మరియు pLK (ఆకుపచ్చ) యొక్క మోలార్ నిష్పత్తులను పెంచుతుందని చూపబడింది.రంగు పంక్తులు ప్రతి వక్రరేఖపై n ఒకేలా మరియు స్వతంత్ర బైండింగ్ సైట్‌లతో కఠినమైన బైండింగ్ మోడల్‌ని ఉపయోగించి డేటాకు సరిపోతాయని చూపుతాయి.ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
పూరకంగా, మేము డైరెక్ట్ స్పిన్ లేబులింగ్ (SDSL) మరియు నిరంతర ఎలక్ట్రాన్ పారామాగ్నెటిక్ రెసొనెన్స్ (CW-EPR)ని ఉపయోగించి వివిధ కోసర్వేట్‌లలో αS యొక్క డైనమిక్స్‌ను పరిశోధించాము.వాస్తవిక అవశేష రిజల్యూషన్36,37,38తో IDP యొక్క వశ్యత మరియు డైనమిక్‌లను నివేదించడంలో ఈ పద్ధతి చాలా ఉపయోగకరంగా ఉందని నిరూపించబడింది.ఈ క్రమంలో, మేము సింగిల్ Cys మార్పుచెందగలవారిలో సిస్టీన్ అవశేషాలను నిర్మించాము మరియు 4-హైడ్రాక్సీ-2,2,6,6-టెట్రామెథైల్పిపెరిడిన్-N-ఆక్సిల్ (TEMPOL) స్పిన్ ప్రోబ్‌ను ఉపయోగించాము.Maleimide ఉత్పన్నాలు వాటిని లేబుల్ చేస్తాయి.మరింత ప్రత్యేకంగా, మేము 122 లేదా 24 αS (TEMPOL-122-αS మరియు TEMPOL-24-αS) స్థానంలో TEMPOL ప్రోబ్‌లను చేర్చాము.మొదటి సందర్భంలో, మేము ప్రోటీన్ యొక్క సి-టెర్మినల్ ప్రాంతాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకుంటాము, ఇది పాలికేషన్‌లతో పరస్పర చర్యలో పాల్గొంటుంది.బదులుగా, 24వ స్థానం మాకు కండెన్సేట్‌లోని ప్రోటీన్‌ల యొక్క మొత్తం డైనమిక్స్ గురించి సమాచారాన్ని అందిస్తుంది.రెండు సందర్భాల్లో, చెదరగొట్టబడిన దశ యొక్క ప్రోటీన్ల కోసం పొందిన EPR సంకేతాలు వేగంగా కదిలే స్థితిలో నైట్రాక్సైడ్ రాడికల్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి.tau లేదా pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 లేదా ΔNt-Tau 1:1 నిష్పత్తిలో లేదా pLK 1:10 నిష్పత్తిలో) సమక్షంలో దశల విభజన తర్వాత, సాపేక్ష గరిష్ట తీవ్రతలో పెరుగుదల గమనించబడింది αS యొక్క EPR స్పెక్ట్రం.పలచని దశలో ప్రోటీన్‌తో పోలిస్తే బిందువులలో తగ్గిన αS రీఓరియంటేషన్ గతిశాస్త్రాన్ని సూచిస్తూ నష్ట రేఖ విస్తరించింది (Fig. 3d, అనుబంధ Fig. 4a).ఈ మార్పులు స్థానం 122 వద్ద మరింత స్పష్టంగా కనిపిస్తాయి. 24వ స్థానంలో pLK ఉనికి ప్రోబ్ యొక్క గతిశాస్త్రంపై ప్రభావం చూపలేదు, 122వ స్థానంలో స్పెక్ట్రల్ లైన్ ఆకారం గణనీయంగా మారింది (అనుబంధ Fig. 4a).స్పిన్-లేబుల్ చేయబడిన IDP38,39 యొక్క డైనమిక్స్‌ను వివరించడానికి సాధారణంగా ఉపయోగించే ఐసోట్రోపిక్ మోడల్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5a)ని ఉపయోగించి రెండు αS/పాలికేషన్ సిస్టమ్‌లలో 122వ స్థానంలో స్పెక్ట్రాను మోడల్ చేయడానికి మేము ప్రయత్నించినప్పుడు, మేము ప్రయోగాత్మక స్పెక్ట్రాను పునర్నిర్మించలేకపోయాము..24 స్పిన్స్ కాంట్రాస్ట్‌ల స్థానం యొక్క వర్ణపట అనుకరణ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5a).పాలికేషన్ల సమక్షంలో αS యొక్క సి-టెర్మినల్ ప్రాంతం యొక్క స్పిన్ కాన్ఫిగరేషన్‌ల ప్రదేశంలో ప్రాధాన్యత స్థానాలు ఉన్నాయని ఇది సూచిస్తుంది.ప్రయోగాత్మక EPR పరిస్థితులలో (84 ± 2%, 79 ± 7%, మరియు 47 ± 4% αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, మరియు αS/pLK, వరుసగా Sup-చూడండి. డేటా విశ్లేషణ c యొక్క Fig. 2e), EPR పద్ధతి ద్వారా కనుగొనబడిన విస్తరణ ప్రధానంగా αS యొక్క C-టెర్మినల్ ప్రాంతం యొక్క పరస్పర చర్యను ఘనీభవించిన దశలో వివిధ పాలికేషన్‌లతో ప్రతిబింబిస్తుంది (TEMPOL-122-ని ఉపయోగిస్తున్నప్పుడు ప్రధాన మార్పు. αS), మరియు ప్రోటీన్ సంక్షేపణం కాదు.మైక్రోవిస్కోసిటీ పెరుగుదల ప్రోబ్‌లో గమనించవచ్చు.ఊహించినట్లుగా, 1 M NaCl మిశ్రమానికి జోడించబడినప్పుడు LLPS కాకుండా ఇతర పరిస్థితులలో ప్రోటీన్ యొక్క EPR స్పెక్ట్రమ్ పూర్తిగా పునరుద్ధరించబడింది (అనుబంధ Fig. 4b).మొత్తంమీద, CW-EPR ద్వారా కనుగొనబడిన మార్పులు ప్రధానంగా αS యొక్క C-టెర్మినల్ ప్రాంతం యొక్క పరస్పర చర్యను ఘనీభవించిన దశలో వివిధ పాలికేషన్‌లతో ప్రతిబింబిస్తాయని మా డేటా సూచిస్తుంది మరియు ఈ పరస్పర చర్య Tauతో పోలిస్తే pLKతో బలంగా ఉన్నట్లు కనిపిస్తుంది.
కోసర్వేట్‌లోని ప్రోటీన్‌ల గురించి మరింత నిర్మాణాత్మక సమాచారాన్ని పొందేందుకు, NMRని ద్రావణంలో ఉపయోగించి LLPS వ్యవస్థను అధ్యయనం చేయాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.అయినప్పటికీ, మేము చెదరగొట్టబడిన దశలో మిగిలి ఉన్న αS భిన్నాన్ని మాత్రమే గుర్తించగలము, ఇది కోసర్వేట్ లోపల తగ్గిన ప్రోటీన్ డైనమిక్స్ మరియు NMR విశ్లేషణలో ద్రావణం దిగువన దట్టమైన దశ కారణంగా ఉండవచ్చు.మేము NMR (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 5c, d) ఉపయోగించి LLPS నమూనా యొక్క చెదరగొట్టబడిన దశలో మిగిలి ఉన్న ప్రోటీన్ యొక్క నిర్మాణం మరియు డైనమిక్‌లను విశ్లేషించినప్పుడు, ప్రోటీన్ pLK మరియు ΔNt-Tau సమక్షంలో దాదాపు ఒకేలా ప్రవర్తించడాన్ని మేము గమనించాము. సెకండరీ స్ట్రక్చర్ మరియు ప్రొటీన్ వెన్నెముక యొక్క డైనమిక్స్‌లో ఉండేవి, సెకండరీ కెమికల్ షిఫ్ట్ మరియు R1ρ రిలాక్సేషన్‌పై ప్రయోగాల ద్వారా వెల్లడయ్యాయి.NMR డేటా, αS యొక్క C-టెర్మినస్ దాని పాలికేషన్‌లతో పరస్పర చర్యల కారణంగా, మిగిలిన ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌లాగా, దాని క్రమరహిత స్వభావాన్ని నిలుపుకుంటూ, కన్ఫర్మేషనల్ ఫ్లెక్సిబిలిటీని గణనీయంగా కోల్పోతుందని చూపిస్తుంది.
TEMPOL-122-αS ఘనీభవించిన దశలో గమనించిన CW-EPR సిగ్నల్ విస్తరణ పాలికేషన్‌లతో ప్రోటీన్ యొక్క పరస్పర చర్యను ప్రతిబింబిస్తుంది కాబట్టి, LLPS లేనప్పుడు వివిధ పాలీకేషన్‌లకు αS యొక్క బంధన అనుబంధాన్ని అంచనా వేయడానికి మేము EPR టైట్రేషన్‌ను ప్రదర్శించాము (ఏ సంచితం లేదు. బఫర్ LLPS), పలుచన మరియు సాంద్రీకృత దశలలో పరస్పర చర్యలు ఒకే విధంగా ఉంటాయని సూచిస్తున్నాయి (ఇది మా డేటా, సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 4a మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 6 ద్వారా నిర్ధారించబడింది).అన్ని కోసర్వేట్‌లు, వాటి సాధారణ ద్రవం లాంటి లక్షణాలు ఉన్నప్పటికీ, పరమాణు స్థాయిలో ఏదైనా అంతర్లీన అవకలన ప్రవర్తనను ప్రదర్శిస్తాయో లేదో చూడటం లక్ష్యం.ఊహించినట్లుగా, EPR స్పెక్ట్రమ్ పెరుగుతున్న పాలికేషన్ ఏకాగ్రతతో విస్తరించింది, దాదాపు సంతృప్తత వరకు అన్ని పరస్పర భాగస్వాముల పరమాణు పరస్పర చర్యల కారణంగా పరమాణు వశ్యత తగ్గుదలని ప్రతిబింబిస్తుంది (Fig. 3e, అనుబంధ Fig. 6).ΔNt-Tau మరియు Tau441 లతో పోలిస్తే pLK ఈ సంతృప్తతను తక్కువ మోలార్ నిష్పత్తిలో (పాలికేషన్:αS) సాధించింది.వాస్తవానికి, n ఒకేలా మరియు స్వతంత్ర బైండింగ్ సైట్‌లను ఊహిస్తూ సుమారుగా బైండింగ్ మోడల్‌తో డేటా యొక్క పోలిక pLK (~ 5 μM) యొక్క స్పష్టమైన డిస్సోసియేషన్ స్థిరాంకం Tau441 లేదా ΔNt-Tau (~50 μM) కంటే తక్కువ పరిమాణంలో ఉన్న క్రమమని చూపించింది. )µM).ఇది స్థూలమైన అంచనా అయినప్పటికీ, నిరంతర ధనాత్మక ఛార్జ్ ప్రాంతాలతో సరళమైన పాలికేషన్‌లకు αS అధిక అనుబంధాన్ని కలిగి ఉందని ఇది సూచిస్తుంది.αS మరియు వివిధ పాలీకేషన్‌ల మధ్య అనుబంధంలో ఉన్న ఈ వ్యత్యాసాన్ని బట్టి, వాటి ద్రవ లక్షణాలు కాలక్రమేణా భిన్నంగా మారవచ్చని మరియు తద్వారా వివిధ LSPT ప్రక్రియలతో బాధపడతారని మేము ఊహించాము.
ప్రోటీన్ కోసర్వేట్‌లోని అత్యంత రద్దీ వాతావరణం మరియు ప్రోటీన్ యొక్క అమిలాయిడ్ స్వభావాన్ని బట్టి, సాధ్యమయ్యే LSPT ప్రక్రియలను గుర్తించడానికి కాలక్రమేణా కోసర్‌వేట్ యొక్క ప్రవర్తనను మేము గమనించాము.BF మరియు CF మైక్రోస్కోపీ (Figure 4) ఉపయోగించి, మేము αS/Tau441 ద్రావణంలో చాలా వరకు కోసర్వేట్ అవుతుందని మేము గమనించాము, ఊహించిన విధంగా బావి/స్లయిడ్ దిగువన ఉన్న ఉపరితలాన్ని పూర్తి బిందువులుగా సంప్రదించి తడి చేసే పెద్ద బిందువులను ఏర్పరుస్తుంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్ . 7d);మేము ఈ దిగువన ఏర్పడిన నిర్మాణాలను "ప్రోటీన్ తెప్పలు" అని పిలుస్తాము.ఈ నిర్మాణాలు ఫ్యూజ్ చేసే సామర్థ్యాన్ని (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7b) నిలుపుకున్నందున అవి ద్రవంగా ఉండిపోయాయి మరియు LLPS ప్రేరేపించబడిన తర్వాత చాలా గంటలు చూడవచ్చు (Fig. 4 మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7c).అసమతుల్యమైన ఛార్జీలు మరియు అధిక ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఉపరితల పొటెన్షియల్‌లతో ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్‌ల కోసం ఆశించినట్లుగా, హైడ్రోఫోబిక్ మెటీరియల్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 7a) కంటే హైడ్రోఫిలిక్ ఉపరితలంపై చెమ్మగిల్లడం ప్రక్రియ అనుకూలంగా ఉంటుందని మేము గమనించాము.ముఖ్యంగా, αS/ΔNt-Tau కోలెసెన్స్ మరియు రాఫ్టింగ్ గణనీయంగా తగ్గాయి, అయితే αS/pLK కండెన్సేట్‌లు గణనీయంగా తగ్గాయి (Fig. 4).చిన్న పొదిగే సమయంలో, αS/pLK బిందువులు హైడ్రోఫిలిక్ ఉపరితలాన్ని కలిపే మరియు తడి చేయగలిగాయి, అయితే ఈ ప్రక్రియ త్వరగా ఆగిపోయింది మరియు 5 గంటల పొదిగే తర్వాత, పరిమిత కోలెసెన్స్ సంఘటనలు మాత్రమే మరియు చెమ్మగిల్లడం గమనించబడలేదు.- జెల్-బిందు పరివర్తన.
LLPS బఫర్‌లో 100 µM αS (1% ఫ్లోరోసెంట్ లేబుల్) కలిగి ఉన్న కోసర్వేట్ నమూనాల ప్రతినిధి BF (గ్రేస్కేల్ ప్యానెల్‌లు) మరియు CF (కుడి ప్యానెల్‌లు, AF488-లేబుల్ αS ఆకుపచ్చ రంగులో ఉన్నాయి) 100 µM సమక్షంలో 100 µM Tau441sctop (పిక్చర్స్) -టౌ (మధ్యలో) లేదా 1 mM pLK (దిగువ) వివిధ పొదిగే సమయాల్లో మరియు ఫోకల్ ఎత్తులు (z, ప్లేట్ బాగా దిగువ నుండి దూరం).ప్రయోగాలు ఒకే ఫలితాలతో ఒకదానికొకటి స్వతంత్రంగా 4-6 సార్లు పునరావృతమయ్యాయి.αS/Tau441 కోసర్వేట్‌లు 24 గంటల తర్వాత తడిపి, చిత్రం కంటే పెద్ద తెప్పలను ఏర్పరుస్తాయి.అన్ని చిత్రాల స్కేల్ బార్ 20 µm.
αS/Tau441 LLPSలో ఏర్పడిన పెద్ద ద్రవం లాంటి ప్రోటీన్ పూల్స్ అధ్యయనం చేసిన ఏదైనా ప్రోటీన్‌ల అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్‌కు దారితీస్తాయా అని మేము అడిగాము.మేము పైన పేర్కొన్న పరిస్థితులలో WF మైక్రోస్కోపీతో కాలక్రమేణా αS/Tau441 చుక్కల పరిపక్వతను అనుసరించాము, అయితే 1 μM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441 (Fig. 5a)ని ఉపయోగించాము.ఊహించిన విధంగా, మేము పరిపక్వ ప్రక్రియ అంతటా పూర్తి ప్రోటీన్ స్థానికీకరణను గమనించాము.ఆసక్తికరంగా, ca నుండి.5 గంటల తర్వాత, తెప్పల లోపల మరింత తీవ్రమైన కాని వృత్తాకార నిర్మాణాలు గమనించబడ్డాయి, వీటిని మేము "పాయింట్లు" అని పిలుస్తాము, వాటిలో కొన్ని αS తో కోలోకలైజ్ చేయబడ్డాయి మరియు కొన్ని Tau441 (Fig. 5a, తెలుపు బాణాలు) లో సుసంపన్నం చేయబడ్డాయి.αS/ΔNt-Tau కంటే αS/ΔNt-Tau కోసం ఈ మచ్చలు ఎల్లప్పుడూ తెప్పలలోనే ఎక్కువగా గమనించబడతాయి.ఫ్యూజన్/చెమ్మగిల్లడం కోసం అసమర్థమైన pLK మరియు టౌ సిస్టమ్‌ల బిందువులలో ప్రత్యేక మచ్చలు లేవు.αS మరియు Tau441 కలిగి ఉన్న ఈ మరకలు అమిలాయిడ్-వంటి కంకరలేనా అని పరీక్షించడానికి, మేము CF మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి ఇదే విధమైన ప్రయోగాన్ని చేసాము, దీనిలో Tau441 ను Atto647N మరియు 12.5 μM అమిలాయిడ్-నిర్దిష్ట థియోఫ్లావిన్-T (ThT) జోడించబడింది.రంగు వేయు.αS/Tau441 చుక్కలు లేదా తెప్పల యొక్క ThT-స్టెయినింగ్ 24 h పొదిగే తర్వాత కూడా గమనించబడనప్పటికీ (Fig. 5b, పై వరుస-ప్రోటీన్ తెప్పలపై మిగిలిన చుక్కలు), తెప్పల లోపల Atto647N-Tau441 కలిగి ఉన్న ThT-పాజిటివ్ నిర్మాణాలు చాలా బలహీనంగా ఉన్నాయి.ఇది గతంలో వివరించిన మచ్చల పరిమాణం, ఆకారం మరియు స్థానాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది (Fig. 5b, మధ్య మరియు దిగువ వరుసలు), మచ్చలు వృద్ధాప్య ద్రవం కోసర్వేట్‌లలో ఏర్పడిన అమిలాయిడ్-వంటి కంకరలకు అనుగుణంగా ఉండవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
WF 25 μM αS వివిధ పొదిగే సమయాల్లో మరియు 25 μM Tau441 (1 μM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441) సమక్షంలో ఫోకల్ ఎత్తులు (z, అన్‌బౌండ్ బాటమ్ నుండి దూరం) LLPS బఫర్ ప్లేట్‌తో మైక్రోస్కోప్ ప్లేట్‌లో .ఇలాంటి ఫలితాలతో ఆరు ప్రయోగాలు స్వతంత్రంగా పునరావృతమయ్యాయి.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441) మరియు 12.5 μM థియోఫ్లావిన్-T (ThT) సమక్షంలో 25 μM αS యొక్క CF మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రం.బరువున్న ప్రోటీన్ బిందువులు మరియు డిపాజిట్ చేయబడిన ప్రోటీన్ తెప్పలు మరియు మచ్చలు వరుసగా ఎగువ మరియు మధ్య వరుసలలో చూపబడతాయి.దిగువ వరుస 3 స్వతంత్ర ప్రతిరూపాల నుండి తెప్పలు మరియు చుక్కల చిత్రాలను చూపుతుంది.తెలుపు బాణాలు రెండు ప్యానెల్‌లలో ThT-పాజిటివ్ చుక్కలను సూచిస్తాయి.అన్ని చిత్రాల స్కేల్ బార్ 20 µm.
ద్రవం నుండి ఘన స్థితికి మారే సమయంలో కోసర్వేట్ ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లోని మార్పులను మరింత వివరంగా పరిశీలించడానికి, మేము ఫ్లోరోసెన్స్ లైఫ్‌టైమ్ ఇమేజింగ్ (FLIM) మరియు Förster రెసొనెన్స్ ఎనర్జీ ట్రాన్స్‌ఫర్ మైక్రోస్కోపీ (FRET) (మూర్తి 6 మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ 8 మరియు 9) ఉపయోగించాము.పొర యొక్క కోసర్వేట్ పరిపక్వత మరింత ఘనీభవించిన లేదా ఘన-వంటి సమగ్ర ప్రోటీన్ నిర్మాణంలో ప్రోటీన్ మరియు దానితో జతచేయబడిన ఫ్లోరోసెంట్ ప్రోబ్ మధ్య సన్నిహిత సంబంధానికి దారితీస్తుందని మేము ఊహిస్తున్నాము, ఇది సంక్షిప్త ప్రోబ్ జీవితకాలం (τ) లో వ్యక్తీకరించబడిన అణచివేత ప్రభావాన్ని ఉత్పత్తి చేస్తుంది. , గతంలో వివరించిన విధంగా40.,41 ,42.అదనంగా, డబుల్ లేబుల్ చేయబడిన నమూనాల కోసం (వరుసగా AF488 మరియు Atto647N FRET దాత మరియు అంగీకరించే రంగులు), τలో ఈ తగ్గుదల కోసర్వేట్ సంగ్రహణ మరియు LSPT సమయంలో FRET(E) సామర్థ్యంలో పెరుగుదలతో కూడి ఉంటుంది.మేము LLPS αS/Tau441 మరియు αS/ΔNt-Tau నమూనాలలో (25 µM LLPS బఫర్‌లోని 1 µM AF488 లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు/లేదా Atto647N Tau441 లేదా Tau లేబుల్ చేయబడిన Tau441 లేదా Tau)లో కాలక్రమేణా తెప్ప మరియు స్పాట్ ఫార్మేషన్‌ను పర్యవేక్షించాము.AF488 (τ488) మరియు Atto647N (τ647N) ప్రోబ్‌ల యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ జీవితకాలం కోసర్‌వేట్‌లు పరిపక్వం చెందడంతో కొద్దిగా తగ్గినట్లు మేము సాధారణ ధోరణిని గమనించాము (Fig. 6 మరియు సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8c).ఆసక్తికరంగా, ఈ మార్పు తెప్పలలోని చుక్కల కోసం గణనీయంగా మెరుగుపరచబడింది (Fig. 6c), చుక్కల వద్ద మరింత ప్రోటీన్ సంగ్రహణ సంభవించిందని సూచిస్తుంది.దీనికి మద్దతుగా, 24 h (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8d) వయస్సు గల αS/ΔNt-Tau చుక్కల కోసం ఫ్లోరోసెన్స్ జీవితకాలంలో గణనీయమైన మార్పు కనిపించలేదు, ఇది బిందువుల జిలేషన్ అనేది చుక్కల నుండి భిన్నమైన ప్రక్రియ అని మరియు ఇది ముఖ్యమైన పరమాణు పునర్వ్యవస్థీకరణతో కలిసి ఉండదని సూచిస్తుంది. కోసర్వేట్స్ లోపల.ముఖ్యంగా αS/Tau441 సిస్టమ్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8e) కోసం చుక్కలు αSలో విభిన్న పరిమాణాలు మరియు వేరియబుల్ కంటెంట్‌ను కలిగి ఉన్నాయని గమనించాలి.స్పాట్ ఫ్లోరోసెన్స్ జీవితకాలంలో తగ్గుదల తీవ్రత పెరుగుదలతో కూడి ఉంది, ప్రత్యేకించి Atto647N లేబుల్ చేయబడిన Tau441 (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8a), మరియు αS/Tau441 మరియు αS/ΔNt-Tau సిస్టమ్‌లు రెండింటికీ అధిక FRET సామర్థ్యాలు, ఐదు గంటల సంక్షేపణను సూచిస్తాయి. ప్రేరేపించిన తర్వాత, స్థిర విద్యుత్ లోపల ప్రోటీన్లు ఘనీభవించబడతాయి.αS/ΔNt-Tauతో పోలిస్తే, మేము αS/Tau441 స్పాట్‌లలో తక్కువ τ647N మరియు కొంత ఎక్కువ τ488 విలువలను గమనించాము, దానితో పాటు తక్కువ మరియు మరింత అసమానమైన FRET విలువలు ఉన్నాయి.బహుశా, ఇది αS/Tau441 సిస్టమ్‌లో, కంకరలలో గమనించిన మరియు ఆశించిన αS సమృద్ధి మరింత భిన్నమైనది, Tauతో పోలిస్తే తరచుగా సబ్‌స్టోయికియోమెట్రిక్‌గా ఉంటుంది, ఎందుకంటే Tau441 కూడా LLPS మరియు అగ్రిగేషన్ (సప్లిమెంటరీ) Fig. .ఏది ఏమైనప్పటికీ, Tau441 మరియు αS రెండూ ఉన్నప్పుడు ద్రవ-వంటి కోసర్వేట్లలో చుక్కల కోలెసెన్స్, తెప్ప ఏర్పడటం మరియు ముఖ్యంగా ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్ స్థాయి గరిష్టంగా ఉంటుంది.
ప్రతి ప్రోటీన్‌లో 25 μM వద్ద αS/Tau441 మరియు αS/ΔNt-Tau యొక్క లైఫ్‌టైమ్ ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ (FLIM) చిత్రాలు (1 μM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు 1 μM Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441 లేదా bFNLL-TauPSలో.నిలువు వరుసలు వేర్వేరు పరిపక్వ సమయాల్లో (30 నిమి, 5 గం మరియు 24 గం) LLPS నమూనాల ప్రతినిధి చిత్రాలను చూపుతాయి.ఎరుపు ఫ్రేమ్ αS/Tau441 మచ్చలు ఉన్న ప్రాంతాన్ని చూపుతుంది.జీవిత కాలాలు రంగు పట్టీలుగా చూపబడ్డాయి.అన్ని చిత్రాలకు స్కేల్ బార్ = 20 µm.b ఎంచుకున్న ప్రాంతం యొక్క జూమ్-ఇన్ FLIM చిత్రం, ప్యానెల్ aలోని ఎరుపు పెట్టెలో చూపబడింది.ప్యానెల్ aలో ఉన్న అదే రంగు స్కేల్‌ని ఉపయోగించి జీవిత పరిధులు చూపబడతాయి.స్కేల్ బార్ = 5 µm.c AF488 (αSకి జోడించబడింది) లేదా Atto647N (Tauకి జతచేయబడింది) చూపించే వివిధ ప్రోటీన్ జాతుల (చుక్కలు-D-, తెప్ప-R- మరియు స్పెకిల్-P) αS- కోసం రికార్డ్ చేయబడిన FLIM చిత్రాలలో గుర్తించబడిన టైమింగ్ డిస్ట్రిబ్యూషన్‌లు Tau441 జీవితకాలం మరియు αS/ΔNt-Tau కోసర్వేట్ నమూనాలు (D కోసం N = 17-32 ROI, R కోసం 29-44 ROI మరియు పాయింట్ల కోసం 21-51 ROI).సగటు మరియు మధ్యస్థ విలువలు వరుసగా పసుపు చతురస్రాలు మరియు బాక్స్‌ల లోపల నలుపు గీతలుగా చూపబడతాయి.బాక్స్ యొక్క దిగువ మరియు ఎగువ సరిహద్దులు వరుసగా మొదటి మరియు మూడవ త్రైమాసికాలను సూచిస్తాయి మరియు 1.5 రెట్లు ఇంటర్‌క్వార్టైల్ పరిధిలో (IQR) కనిష్ట మరియు గరిష్ట విలువలు మీసాలుగా చూపబడతాయి.అవుట్‌లియర్‌లు నల్ల వజ్రాలుగా చూపబడ్డాయి.జతల పంపిణీల మధ్య గణాంక ప్రాముఖ్యత అసమాన వ్యత్యాసాలను ఊహిస్తూ రెండు-నమూనా t- పరీక్షను ఉపయోగించి నిర్ణయించబడింది.పోల్చబడిన డేటా యొక్క ప్రతి జత కోసం రెండు-తోక గల t-పరీక్ష p-విలువలు ఆస్టరిస్క్‌లతో చూపబడతాయి (* p-విలువ > 0.01, ** p-విలువ > 0.001, *** p-విలువ > 0.0001, **** p-విలువ > 0.00001), ns నిర్లక్ష్యతను సూచిస్తుంది (p-విలువ > 0.05).ఖచ్చితమైన p విలువలు సప్లిమెంటరీ టేబుల్ 1లో ఇవ్వబడ్డాయి మరియు అసలు డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌లుగా ప్రదర్శించబడుతుంది.
స్పెక్కిల్స్/అగ్రిగేట్‌ల యొక్క అమిలాయిడ్-వంటి స్వభావాన్ని మరింత ప్రదర్శించడానికి, మేము (1 M) NaCl అధిక సాంద్రతతో 24 గంటల పాటు స్టెయిన్ చేయని కోసర్‌వేట్ నమూనాలను చికిత్స చేసాము, దీని ఫలితంగా ప్రోటీన్ కోసర్‌వేట్‌ల నుండి కంకర వేరు చేయబడింది.అటామిక్ ఫోర్స్ మైక్రోస్కోపీ (AFM)ని ఉపయోగించి వివిక్త కంకరలను (అనగా, సముదాయాల యొక్క చెదరగొట్టబడిన పరిష్కారం) గమనించినప్పుడు, మేము దాదాపు 15 nm యొక్క సాధారణ ఎత్తుతో ప్రధానంగా గోళాకార స్వరూపాన్ని గమనించాము, ఇది అధిక ఉప్పు సాంద్రత ఉన్న పరిస్థితులలో అనుబంధించబడుతుంది. ఉపరితలంపై బలమైన హైడ్రోఫోబిక్ ప్రభావం కారణంగా సాధారణ అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ యొక్క ప్రవర్తన (ఫైబ్రిల్స్ సాధారణంగా ~10 nm ఎత్తును కలిగి ఉంటాయని గమనించండి) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 10a).ఆసక్తికరంగా, ప్రామాణిక ThT ఫ్లోరోసెన్స్ అస్సేలో వివిక్త కంకరలను ThTతో పొదిగినప్పుడు, మేము ThT ఫ్లోరోసెన్స్ క్వాంటం దిగుబడిలో అనూహ్య పెరుగుదలను గమనించాము, రంగును సాధారణ αS అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిబ్రిల్స్)తో పొదిగినప్పుడు గమనించిన దానితో పోల్చవచ్చు. కోసర్వేట్ కంకరలు అమిలాయిడ్ లాంటి నిర్మాణాలను కలిగి ఉంటాయి..నిజానికి, కంకరలు అధిక ఉప్పు సాంద్రతలను తట్టుకోగలవు కానీ సాధారణ అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 10c) వంటి 4 M గ్వానిడైన్ క్లోరైడ్ (GdnHCl)కి సున్నితంగా ఉంటాయి.
తరువాత, మేము సింగిల్ మాలిక్యూల్ ఫ్లోరోసెన్స్, నిర్దిష్ట ఫ్లోరోసెన్స్ కోరిలేషన్/క్రాస్-కోరిలేషన్ స్పెక్ట్రోస్కోపీ (FCS/FCCS) మరియు టూ-కలర్ యాదృచ్చిక గుర్తింపు (TCCD) యొక్క బర్స్ట్ అనాలిసిస్‌ని ఉపయోగించి కంకరల కూర్పును విశ్లేషించాము.ఈ క్రమంలో, మేము 100 μl LLPS నమూనాలలో αS మరియు Tau441 (రెండూ 25 μM) 1 μM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS మరియు 1 μM Atto647N-లేబుల్ చేయబడిన Tau441తో కలిపి 24 గంటల పొదిగే తర్వాత ఏర్పడిన కంకరలను వేరు చేసాము.LLPS మరియు ప్రోటీన్ల మధ్య సాధ్యమయ్యే ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యలను నిరోధించడానికి అదే PEG-రహిత బఫర్ మరియు 1 M NaCl (కోసర్వేట్ నుండి కంకరలను వేరు చేయడానికి ఉపయోగించే అదే బఫర్)ని ఉపయోగించి ఫలితంగా చెదరగొట్టబడిన మొత్తం ద్రావణాన్ని మోనోమోలిక్యులర్ స్థితికి తగ్గించండి.ఒకే అణువు యొక్క సమయ పథం యొక్క ఉదాహరణను అంజీర్ 7aలో చూడవచ్చు.FCCS/FCS విశ్లేషణ (క్రాస్-కోరిలేషన్, CC మరియు ఆటోకోరిలేషన్, AC) నమూనాలలో αS మరియు టౌ కలిగిన కంకరలు సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించింది (Fig. 7b, ఎడమ పానెల్‌లోని CC వక్రరేఖను చూడండి), మరియు అవశేష మోనోమెరిక్ ప్రోటీన్‌లు అధికంగా ఉద్భవించాయి. పలుచన ప్రక్రియ యొక్క ఫలితం (చిత్రం 7b, ఎడమ పానెల్‌లోని AC వక్రతలను చూడండి).మోనోమెరిక్ ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే కలిగి ఉన్న నమూనాలను ఉపయోగించి అదే పరిష్కార పరిస్థితులలో నిర్వహించబడిన నియంత్రణ ప్రయోగాలు CC వక్రతలను చూపించలేదు మరియు AC వక్రతలు ఒక-భాగాల వ్యాప్తి నమూనా (Eq. 4)తో బాగా సరిపోతాయి, ఇక్కడ మోనోమెరిక్ ప్రోటీన్‌లు ఆశించిన వ్యాప్తి గుణకాలను కలిగి ఉంటాయి (Fig. 7b. ), కుడి పానెల్).సమగ్ర కణాల వ్యాప్తి గుణకం 1 µm2/s కంటే తక్కువగా ఉంటుంది మరియు మోనోమెరిక్ ప్రోటీన్ల 1 µm2/s.50-100 µm/s;సోనికేటెడ్ αS అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ మరియు మోనోమెరిక్ αS కోసం విడివిడిగా సారూప్య పరిష్కార పరిస్థితులలో గతంలో ప్రచురించిన విలువలకు విలువలు సమానంగా ఉంటాయి44.మేము TCCD పేలుడు విశ్లేషణ (Fig. 7c, టాప్ ప్యానెల్)తో కంకరలను విశ్లేషించినప్పుడు, ప్రతి వివిక్త మొత్తంలో (αS/Tau హెటెరోఅగ్రిగేట్), గుర్తించబడిన కంకరలలో 60% αS మరియు tau రెండింటినీ కలిగి ఉన్నాయని, దాదాపు 30% మాత్రమే కలిగి ఉన్నాయని మేము కనుగొన్నాము. టౌ, సుమారు 10% αS మాత్రమే.αS/Tau హెటెరోఅగ్రిగేట్‌ల యొక్క స్టోయికియోమెట్రిక్ విశ్లేషణ చాలా హెటెరోఅగ్రిగేట్‌లు టౌలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించింది (స్టోయికియోమెట్రీ 0.5 కంటే తక్కువ, సగటున టౌ అణువుల సంఖ్య మొత్తం αS అణువుల కంటే 4 రెట్లు ఎక్కువ), ఇది మా పనిలో గమనించిన FLIMకి అనుగుణంగా ఉంటుంది. ప్రయోగాలు..FRET విశ్లేషణ ఈ కంకరలలో రెండు ప్రోటీన్‌లు ఉన్నాయని చూపించింది, అయినప్పటికీ ఈ సందర్భంలో వాస్తవ FRET విలువలకు పెద్ద ప్రాముఖ్యత లేదు, ఎందుకంటే ప్రయోగంలో ఉపయోగించిన లేబుల్ లేని ప్రోటీన్‌ల కారణంగా ప్రతి కంకరలో ఫ్లోరోఫోర్స్ పంపిణీ యాదృచ్ఛికంగా ఉంది.ఆసక్తికరంగా, మేము 45,46 పరిపక్వ అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్-లోపం ఉన్న టౌ వేరియంట్‌ను ఉపయోగించి అదే విశ్లేషణ చేసినప్పుడు (అనుబంధ Fig. 11a,b చూడండి), αS ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ అగ్రిగేషన్ ఒకేలా ఉన్నప్పటికీ (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 11c, d) కోసర్వేట్‌లో కంకరలను ఏర్పరుచుకునే సామర్థ్యం బాగా తగ్గిపోయింది మరియు FLIM సిటు ప్రయోగాలలో అనేక మచ్చలను గుర్తించింది మరియు వివిక్త మొత్తం నమూనాల కోసం బలహీనమైన క్రాస్ కోరిలేషన్ వక్రతలు గమనించబడ్డాయి.అయినప్పటికీ, తక్కువ సంఖ్యలో గుర్తించబడిన కంకరల కోసం (Tau441లో పదోవంతు మాత్రమే), ఈ Tau వేరియంట్ కంటే ప్రతి మొత్తం αSలో సమృద్ధిగా ఉందని మేము గమనించాము, కనుగొనబడిన కంకరలలో సుమారు 50% αS అణువులను మాత్రమే కలిగి ఉంది మరియు αS అధికంగా వైవిధ్యమైనది. .Tau441 (Fig. 6f) ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన విజాతీయ కంకరలకు విరుద్ధంగా కంకరలు (అనుబంధ Fig. 11e చూడండి).ఈ ప్రయోగాల ఫలితాలు αS కూడా కోసర్వేట్‌లో టౌతో పేరుకుపోయే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉన్నప్పటికీ, ఈ పరిస్థితులలో టౌ న్యూక్లియేషన్ మరింత అనుకూలంగా ఉంటుంది మరియు ఫలితంగా ఏర్పడే అమిలాయిడ్-వంటి కంకరలు αS మరియు టౌ రూపంగా పని చేయగలవు.అయితే, ఒకసారి టౌ-రిచ్ కోర్ ఏర్పడిన తర్వాత, టౌ అణువుల మధ్య హోమోటైపిక్ ఇంటరాక్షన్‌ల కంటే αS మరియు టౌ మధ్య హెటెరోటైపిక్ ఇంటరాక్షన్‌లు మొత్తానికి అనుకూలంగా ఉంటాయి;మేము ద్రవ αS/టౌ కోసర్వేట్‌లలో ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లను కూడా గమనిస్తాము.
αS/Tau441 ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్‌లలో ఏర్పడిన వివిక్త కంకరల యొక్క ఒకే అణువుల యొక్క ప్రతినిధి ఫ్లోరోసెన్స్ తాత్కాలిక జాడలు.αS/Tau441 coaggregates (సూచించిన థ్రెషోల్డ్ పైన ఉన్న పేలుళ్లు)కు సంబంధించిన పేలుళ్లు మూడు డిటెక్షన్ ఛానెల్‌లలో గమనించబడ్డాయి (AF488 మరియు Atto647N ప్రత్యక్ష ప్రేరణ తర్వాత ఉద్గారాలు, నీలం మరియు ఎరుపు గీతలు, పరోక్ష ఉత్తేజితం తర్వాత Atto647N ఉద్గారాలు), FRET, వైలెట్ లైన్).b LLPS (ఎడమ పానెల్) నుండి పొందిన వివిక్త αS/Tau441 కంకరల నమూనా యొక్క FCS/FCCS విశ్లేషణ.AF488 మరియు Atto647N కోసం ఆటోకోరిలేషన్ (AC) వక్రతలు వరుసగా నీలం మరియు ఎరుపు రంగులలో చూపబడ్డాయి మరియు రెండు రంగులను కలిగి ఉన్న కంకరలతో అనుబంధించబడిన క్రాస్ కోరిలేషన్ (CC) వక్రతలు ఊదా రంగులో చూపబడ్డాయి.AC వక్రతలు లేబుల్ చేయబడిన మోనోమెరిక్ మరియు సమగ్ర ప్రోటీన్ జాతుల ఉనికిని ప్రతిబింబిస్తాయి, అయితే CC వక్రతలు డబుల్-లేబుల్ కంకరల వ్యాప్తిని మాత్రమే చూపుతాయి.అదే విశ్లేషణ, కానీ వివిక్త ప్రదేశాలలో ఉన్న అదే పరిష్కార పరిస్థితులలో, మోనోమెరిక్ αS మరియు Tau441 మాత్రమే ఉన్న నమూనాలు కుడి ప్యానెల్‌లో నియంత్రణలుగా చూపబడతాయి.c ఫ్లోరోసెన్స్ ఫ్లాష్ విశ్లేషణ αS/Tau441 ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్‌లలో ఏర్పడిన వివిక్త కంకరల యొక్క ఒకే అణువుల విశ్లేషణ.నాలుగు వేర్వేరు పునరావృతాలలో (N = 152) కనుగొనబడిన ప్రతి మొత్తం సమాచారం వాటి స్టోయికియోమెట్రీ, S విలువలు మరియు FRET సామర్థ్యం (టాప్ ప్యానెల్, కలర్ బార్ సంభవనీయతను ప్రతిబింబిస్తుంది)కి వ్యతిరేకంగా రూపొందించబడింది.మూడు రకాల కంకరలను వేరు చేయవచ్చు: S~1 మరియు FRET~0తో -αS-మాత్రమే కంకరలు, S~0 మరియు FRET~1తో Tau-మాత్రమే కంకరలు మరియు ఇంటర్మీడియట్ S మరియు FRET అంచనాలతో భిన్నమైన Tau/αS కంకరలు ప్రతి వైవిధ్య మొత్తం (N = 100)లో కనుగొనబడిన రెండు మార్కర్ ప్రోటీన్‌లు దిగువ ప్యానెల్‌లో చూపబడతాయి (రంగు స్కేల్ సంభవించడాన్ని ప్రతిబింబిస్తుంది).ముడి డేటా ముడి డేటా ఫైల్‌ల రూపంలో అందించబడుతుంది.
ద్రవ ప్రోటీన్ యొక్క పరిపక్వత లేదా వృద్ధాప్యం కాలక్రమేణా జెల్-వంటి లేదా ఘన నిర్మాణాలలోకి ఘనీభవిస్తుంది, ఇది అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ 7, 48, 49కి ముందు అసాధారణ ప్రక్రియగా, కండెన్సేట్47 యొక్క అనేక శారీరక విధుల్లో అలాగే వ్యాధిలో పాల్గొంటున్నట్లు నివేదించబడింది. మేము దశల విభజన మరియు ప్రవర్తనను వివరంగా అధ్యయనం చేస్తాము.LPS యొక్క సాధారణ థర్మోడైనమిక్‌గా నడిచే ప్రవర్తనను అనుసరించి, తక్కువ మైక్రోమోలార్ సాంద్రతలు మరియు శారీరకంగా సంబంధిత పరిస్థితులలో (αS యొక్క గణించిన శారీరక సాంద్రత >1 µM50 అని గమనించండి) వద్ద నియంత్రిత వాతావరణంలో యాదృచ్ఛిక పాలికేషన్‌ల సమక్షంలో LSPT αS.ఫిజియోలాజికల్ pH వద్ద అత్యంత ప్రతికూలంగా చార్జ్ చేయబడిన C-టెర్మినల్ ప్రాంతాన్ని కలిగి ఉన్న αS, ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ ప్రక్రియ ద్వారా pLK లేదా టౌ వంటి అధిక కాటినిక్ డిజార్డర్ పెప్టైడ్‌ల సమక్షంలో LLPS ద్వారా సజల ద్రావణంలో ప్రోటీన్-రిచ్ బిందువులను ఏర్పరుస్తుందని మేము కనుగొన్నాము. అగ్రిగేషన్ స్థూల కణాల సమక్షంలో సంక్లిష్ట సంక్షేపణం.ఈ ప్రక్రియ సెల్యులార్ వాతావరణంలో సంబంధిత ప్రభావాలను కలిగి ఉండవచ్చు, ఇక్కడ αS విట్రో మరియు vivo51,52,53,54 రెండింటిలోనూ దాని వ్యాధి-సంబంధిత అగ్రిగేషన్‌తో అనుబంధించబడిన వివిధ పాలికేషనిక్ అణువులను ఎదుర్కొంటుంది.
అనేక అధ్యయనాలలో, బిందువులలోని ప్రోటీన్ డైనమిక్స్ పరిపక్వత ప్రక్రియను నిర్ణయించే ముఖ్య కారకాల్లో ఒకటిగా పరిగణించబడుతుంది55,56.ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ αS పాలికేషన్‌లతో కోసర్వేట్‌లలో, పరిపక్వత ప్రక్రియ స్పష్టంగా పాలికేషన్‌లతో పరస్పర చర్యల బలం, వాలెన్స్ మరియు ఈ పరస్పర చర్యల గుణకారంపై ఆధారపడి ఉంటుంది.సమతౌల్య సిద్ధాంతం రెండు ద్రవ స్థితుల యొక్క సమతౌల్య ప్రకృతి దృశ్యం LLPS57,58ని నడిపించే బయోపాలిమర్‌లలో సమృద్ధిగా ఉన్న పెద్ద బిందువు యొక్క ఉనికిని సూచిస్తుంది.ఆస్ట్వాల్డ్ పరిపక్వత59, కోలెసెన్స్60 లేదా చెదరగొట్టబడిన దశ61లో ఉచిత మోనోమర్ వినియోగం ద్వారా బిందు వృద్ధిని సాధించవచ్చు.αS మరియు Tau441, ΔNt-Tau లేదా pLK కోసం, ఈ అధ్యయనంలో ఉపయోగించిన పరిస్థితులలో చాలా వరకు ప్రోటీన్ సంగ్రహణలో కేంద్రీకృతమై ఉంటుంది.అయినప్పటికీ, ఉపరితల చెమ్మగిల్లడంపై పూర్తి-పరిమాణ టౌ బిందువులు వేగంగా కలిసిపోతాయి, ΔNt-Tau మరియు pLK లకు బిందువుల కలయిక మరియు చెమ్మగిల్లడం కష్టంగా ఉంది, ఈ రెండు వ్యవస్థలలో ద్రవ లక్షణాలను వేగంగా కోల్పోవడాన్ని సూచిస్తుంది.మా FLIM-FRET విశ్లేషణ ప్రకారం, వృద్ధాప్య pLK మరియు ΔNt-Tau బిందువులు అసలు చుక్కల మాదిరిగానే ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్ (ఇలాంటి ఫ్లోరోసెన్స్ జీవితకాలం)ను చూపించాయి, అసలు ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్ మరింత దృఢంగా ఉన్నప్పటికీ అలాగే ఉంచబడిందని సూచిస్తుంది.
మేము మా ప్రయోగాత్మక ఫలితాలను క్రింది మోడల్‌లో హేతుబద్ధం చేస్తాము (మూర్తి 8).ప్రారంభంలో తాత్కాలికంగా ఏర్పడిన బిందువులు తరచుగా ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరిహారం లేకుండా ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లుగా ఉంటాయి మరియు అందువల్ల ఛార్జ్ అసమతుల్యత ప్రాంతాలు ఉన్నాయి, ముఖ్యంగా బిందువు ఇంటర్‌ఫేస్ వద్ద, ఫలితంగా అధిక ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఉపరితల సంభావ్యతతో బిందువులు ఏర్పడతాయి.ఛార్జ్‌ను భర్తీ చేయడానికి (సాధారణంగా వాలెన్స్ క్షీణత అని పిలువబడే ఒక దృగ్విషయం) మరియు బిందువుల ఉపరితల సంభావ్యతను తగ్గించడానికి, బిందువులు పలుచన దశ నుండి కొత్త పాలీపెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉంటాయి, ఛార్జ్-ఛార్జ్ ఇంటరాక్షన్‌లను ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లను పునర్వ్యవస్థీకరించవచ్చు మరియు ఇతర బిందువులతో సంకర్షణ చెందుతాయి.ఉపరితలాలతో (చెమ్మగిల్లడం).αS/pLK బిందువులు, వాటి సరళమైన ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్ (αS మరియు pLK మధ్య హెటెరోటైపిక్ ఇంటరాక్షన్‌లు మాత్రమే) మరియు ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్‌లకు ఎక్కువ అనుబంధం కారణంగా, కండెన్సేట్ యొక్క ఛార్జ్‌ను మరింత త్వరగా బ్యాలెన్స్ చేయగలవు;నిజానికి, మేము αS/Tau కంటే ప్రారంభంలో ఏర్పడిన αS/pLK కోసర్వేట్‌లలో వేగవంతమైన ప్రోటీన్ గతిశాస్త్రాన్ని గమనించాము.వాలెన్స్ క్షీణత తర్వాత, పరస్పర చర్యలు తక్కువ అశాశ్వతంగా మారతాయి మరియు చుక్కలు వాటి ద్రవ లక్షణాలను కోల్పోతాయి మరియు తక్కువ ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఉపరితల సంభావ్యతతో (అందువలన ఉపరితలం తడి చేయలేక) జెల్-వంటి, మండే కాని బిందువులుగా మారుతాయి.దీనికి విరుద్ధంగా, αS/Tau బిందువులు మరింత సంక్లిష్టమైన ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లు (హోమోటైపిక్ మరియు హెటెరోటైపిక్ ఇంటరాక్షన్‌లతో) మరియు ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యల యొక్క బలహీన స్వభావం కారణంగా బిందు ఛార్జ్ బ్యాలెన్స్‌ని ఆప్టిమైజ్ చేయడంలో తక్కువ సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి.దీని ఫలితంగా ఎక్కువ కాలం పాటు ద్రవ ప్రవర్తనను నిలుపుకునే మరియు అధిక ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఉపరితల సంభావ్యతను ప్రదర్శించే చుక్కలు ఏర్పడతాయి, ఇవి కలుస్తాయి మరియు పెరగడం ద్వారా తగ్గించబడతాయి (తద్వారా బిందువుల ఉపరితల వైశాల్యం/వాల్యూమ్ నిష్పత్తిని తగ్గించడం) మరియు హైడ్రోఫిలిక్ ఉపరితల రసాయనాన్ని తడి చేయడం ద్వారా.ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లో ఛార్జ్ ఆప్టిమైజేషన్ కోసం స్థిరమైన శోధన కారణంగా పరస్పర చర్యలు చాలా తాత్కాలికంగా ఉంటాయి కాబట్టి ఇది ద్రవ లక్షణాలను నిలుపుకునే పెద్ద సాంద్రీకృత ప్రోటీన్ లైబ్రరీలను సృష్టిస్తుంది.ఆసక్తికరంగా, కొన్ని సహజంగా సంభవించే ఐసోఫాంలు62తో సహా టౌ యొక్క N-అంతర్గతంగా కత్తిరించబడిన రూపాలు మధ్యంతర ప్రవర్తనను ప్రదర్శిస్తాయి, కొన్ని కోసర్వేట్‌లు αSతో వృద్ధాప్యంతో దీర్ఘకాల జెల్-వంటి బిందువులుగా మారతాయి, మరికొన్ని పెద్ద ద్రవ సంగ్రహణలుగా రూపాంతరం చెందుతాయి.αS ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్‌ల పరిపక్వతలో ఈ ద్వంద్వత ఇటీవలి LLPS సైద్ధాంతిక మరియు ప్రయోగాత్మక అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంది, ఇది కండెన్సేట్ పరిమాణం మరియు ద్రవ లక్షణాలను నియంత్రించడంలో కీలకంగా కండెన్సేట్‌లలో వాలెన్స్ క్షీణత మరియు ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ జల్లెడ మధ్య పరస్పర సంబంధాన్ని గుర్తించింది.మెకానిజం 58.61.
ఈ పథకం LLPS మరియు LSPT ద్వారా αS మరియు Tau441 కోసం పుటేటివ్ అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ పాత్‌వేని చూపుతుంది.అదనపు అయాన్-రిచ్ (ఎరుపు) మరియు కేషన్-రిచ్ (నీలం) ప్రాంతాలతో, సంతృప్తికరమైన వాలెన్స్‌తో కూడిన αS మరియు టౌ ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్వేట్‌లు తక్కువ ఉపరితల శక్తిని కలిగి ఉంటాయి మరియు అందువల్ల తక్కువ కోలెసెన్స్ కలిగి ఉంటాయి, ఫలితంగా వేగంగా బిందువుల వృద్ధాప్యం ఏర్పడుతుంది.స్థిరమైన నాన్-అగ్లోమరేటెడ్ జెల్ స్థితి సాధించబడుతుంది..ఈ పరిస్థితి αS/pLK వ్యవస్థ విషయంలో దాని అధిక అనుబంధం మరియు సరళమైన ప్రోటీన్-పెయిర్ ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్ కారణంగా చాలా అనుకూలంగా ఉంటుంది, ఇది వేగవంతమైన జెల్-వంటి పరివర్తనను అనుమతిస్తుంది.దీనికి విరుద్ధంగా, సంతృప్తికరమైన వాలెన్స్‌తో కూడిన బిందువులు మరియు అందువల్ల పరస్పర చర్య కోసం అందుబాటులో ఉన్న ప్రోటీన్-ఛార్జ్డ్ ప్రాంతాలు, కోసర్‌వేట్ దాని అధిక ఉపరితల శక్తిని తగ్గించడానికి హైడ్రోఫిలిక్ ఉపరితలాన్ని ఫ్యూజ్ చేయడం మరియు తడి చేయడం సులభం చేస్తుంది.బలహీనమైన Tau-Tau మరియు αS-Tau పరస్పర చర్యలతో కూడిన మల్టీవాలెంట్ కాంప్లెక్స్ నెట్‌వర్క్‌ను కలిగి ఉన్న αS/Tau441 కోసర్వేట్‌లకు ఈ పరిస్థితి ఉత్తమం.ప్రతిగా, పెద్ద కోసర్వేట్‌లు వాటి ద్రవం-వంటి లక్షణాలను మరింత సులభంగా నిలుపుకుంటాయి, ఇతర ప్రోటీన్-టు-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను అనుమతిస్తుంది.చివరికి, కోసర్వేట్ ద్రవంలో αS మరియు టౌ రెండింటినీ కలిగి ఉన్న అమిలాయిడ్ వైవిధ్య కంకరలు ఏర్పడతాయి, ఇవి న్యూరోడెజెనరేటివ్ వ్యాధుల లక్షణాలైన ఇన్‌క్లూజన్ బాడీలలో కనిపించే వాటికి సంబంధించినవి కావచ్చు.
αS/Tau441 పరిపక్వత సమయంలో ఏర్పడిన పెద్ద ద్రవం-వంటి నిర్మాణాలు అత్యంత రద్దీగా ఉండే కానీ డైనమిక్ ప్రోటీన్ వాతావరణంతో మరియు కొంత మేరకు, αS/ΔNt-Tau కోసర్వేట్‌లు ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్ యొక్క న్యూక్లియేషన్‌కు అనువైన రిజర్వాయర్‌లు.ఈ రకమైన ప్రోటీన్ కోసర్వేట్‌లలో ఘన ప్రోటీన్ కంకరలు ఏర్పడటాన్ని మేము నిజంగా గమనించాము, తరచుగా αS మరియు టౌ రెండింటినీ కలిగి ఉంటుంది.ఈ హెటెరోఅగ్రిగేట్‌లు నాన్-ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఇంటరాక్షన్‌ల ద్వారా స్థిరీకరించబడతాయని, అమిలాయిడ్-నిర్దిష్ట ThT డైలను సాధారణ అమిలాయిడ్ ఫైబ్రిల్స్ మాదిరిగానే బంధించగలవని మరియు నిజానికి వివిధ ప్రభావాలకు సమానమైన ప్రతిఘటనను కలిగి ఉన్నాయని మేము చూపించాము.LLPS ద్వారా ఏర్పడిన αS/tau కంకరలు అమిలాయిడ్-వంటి లక్షణాలను కలిగి ఉన్నట్లు చూపబడింది.నిజమే, అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్‌లో టౌ లోపం ఉన్న పరిపక్వ వైవిధ్యం ద్రవ ఎలక్ట్రోస్టాటిక్ కోసర్‌వేట్‌లో ఈ భిన్నమైన αS కంకరల ఏర్పాటులో గణనీయంగా బలహీనపడింది.αS/Tau441 కంకరల నిర్మాణం కోసర్వేట్‌ల లోపల మాత్రమే గమనించబడింది, ఇది ద్రవ-వంటి లక్షణాలను నిలుపుకుంది మరియు కోసర్‌వేట్‌లు/చుక్కలు జెల్ స్థితికి చేరుకోకపోతే ఎప్పుడూ.తరువాతి సందర్భంలో, ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ పరస్పర చర్యల యొక్క పెరిగిన బలం మరియు ఫలితంగా, ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్ యొక్క దృఢత్వం అమిలాయిడ్ న్యూక్లియేషన్‌కు అవసరమైన కొత్త ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను స్థాపించడానికి ప్రోటీన్ల యొక్క అవసరమైన ఆకృతీకరణ పునర్వ్యవస్థీకరణలను నిరోధిస్తుంది.అయినప్పటికీ, ఇది మరింత సౌకర్యవంతమైన, ద్రవ-వంటి కోసర్వేట్‌లలో సాధించవచ్చు, అవి పరిమాణంలో పెరిగేకొద్దీ ద్రవంగా ఉండే అవకాశం ఉంది.
చిన్న బిందువుల కంటే పెద్ద αS/Tau కండెన్సేట్‌లలో ఘనీభవించిన దశలో కంకర ఏర్పడటం ఉత్తమం అనే వాస్తవం, చుక్కల కలయికను నియంత్రించే కారకాలను గుర్తించడంలో ఔచిత్యాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది.అందువల్ల, దశల విభజనకు ధోరణి మాత్రమే కాకుండా, సరైన పనితీరుతో పాటు వ్యాధి నివారణకు కండెన్సేట్ పరిమాణాన్ని నియంత్రించాలి58,61.మా ఫలితాలు αS/Tau సిస్టమ్ కోసం LLPS మరియు LSPT మధ్య సమతుల్యత యొక్క ప్రాముఖ్యతను కూడా హైలైట్ చేస్తాయి.ఇతర వ్యవస్థలలో ప్రతిపాదించబడినట్లుగా, సంతృప్త పరిస్థితులలో లభించే ప్రోటీన్ మోనోమర్‌ల పరిమాణాన్ని తగ్గించడం ద్వారా బిందువుల నిర్మాణం అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్ నుండి రక్షించవచ్చు, అయితే అధిక బిందువుల స్థాయిలలో బిందువుల కలయిక నెమ్మదిగా కన్ఫర్మేషనల్ పునర్వ్యవస్థీకరణల ద్వారా అంతర్గత ప్రోటీన్ అగ్రిగేషన్‌కు దారితీయవచ్చు.ప్రోటీన్ నెట్వర్క్లు..
మొత్తంమీద, LSPT సందర్భంలో డ్రాప్ నెట్‌వర్క్‌లలో సంతృప్త వాలెన్స్ మరియు సంతృప్తికరమైన/సంతృప్తి చెందని పరస్పర చర్యల యొక్క ఔచిత్యాన్ని మా డేటా గట్టిగా నొక్కి చెబుతుంది.ప్రత్యేకించి, పూర్తి-నిడివి గల αS/Tau441 కండెన్సేట్‌లు సమర్ధవంతంగా ఫ్యూజ్ చేయగలవు మరియు న్యూక్లియేట్ చేయగలవని అమిలాయిడ్-వంటి హెటెరోఅగ్రిగేట్‌లను ఏర్పరుస్తాయని మేము చూపిస్తాము, ఇవి ప్రోటీన్‌లు రెండింటినీ కలిగి ఉంటాయి మరియు మా ప్రయోగాత్మక ఫలితాల ఆధారంగా పరమాణు యంత్రాంగాన్ని ప్రతిపాదిస్తాయి.మేము ఇక్కడ నివేదించిన αS/Tau ఫ్లూయిడ్ కోసర్వేట్‌లోని రెండు ప్రొటీన్‌ల కో-అగ్రిగేషన్ నిజానికి ఇన్‌క్లూషన్‌లలోని రెండు ప్రోటీన్‌ల సహ-స్థానికీకరణకు సంబంధించినది కావచ్చు, ఇవి వ్యాధి యొక్క ముఖ్య లక్షణాలు మరియు LLPS మరియు LLPS మధ్య సంబంధాన్ని అర్థం చేసుకోవడానికి దోహదం చేస్తాయి. అమిలాయిడ్ అగ్రిగేషన్, న్యూరోడెజెనరేషన్‌లో అధికంగా చార్జ్ చేయబడిన IDPకి మార్గం సుగమం చేస్తుంది.
మోనోమెరిక్ WT-αS, సిస్టీన్ ఉత్పరివర్తనలు (Q24C-αS, N122C-αS) మరియు ΔCt-αS రూపాంతరాలు (Δ101-140) E. coliలో వ్యక్తీకరించబడ్డాయి మరియు గతంలో వివరించిన విధంగా శుద్ధి చేయబడ్డాయి.డైసల్ఫైడ్ బాండ్ ఏర్పడకుండా నిరోధించడానికి αS సిస్టీన్ మార్పుచెందగలవారి శుద్దీకరణలో 5 mM DTT అన్ని దశలలో చేర్చబడింది.Tau441 ఐసోఫార్మ్ (ఆడ్‌జీన్ #16316 నుండి పొందిన ప్లాస్మిడ్), ΔNt-Tau వేరియంట్ (Δ1–150, ప్రైమర్‌లతో IVAను క్లోనింగ్ చేయడం ద్వారా పొందబడింది CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGCGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAAGGG, CATGTATATCCTCTCTTCTTAA-12AGTAF-1వరి, AggTAF7 GGCTC5 ప్రైమర్‌తో రూపొందించబడింది) E. కోలి సంస్కృతులు 37°C మరియు 180 rpm వద్ద OD600 = 0.6–0.7కి పెరిగింది మరియు వ్యక్తీకరణ 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు IPTGతో ప్రేరేపించబడింది.4 °C వద్ద 15 నిమిషాలకు 11,500 xg వద్ద కణాలను హార్వెస్ట్ చేయండి మరియు 150 mM NaCl కలిగిన సెలైన్ బఫర్‌తో కడగాలి.లైసిస్ బఫర్‌లో గుళికను మళ్లీ సస్పెండ్ చేయండి (1 L LBకి 20 ml: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, బెంజమిడిన్ 50 μM1, copeptin 50 μM1).సోనికేషన్ దశ 10 పప్పుల కోసం 80% వ్యాప్తితో మంచుపై ప్రదర్శించబడింది (1 నిమి, 1 నిమి ఆఫ్).ఒక అల్ట్రాసౌండ్లో 60 ml కంటే ఎక్కువ ఉండకూడదు.E. కోలి లైసేట్‌లను 95° C. వద్ద 20 నిమిషాల పాటు వేడి చేసి, తర్వాత మంచు మీద చల్లబరుస్తుంది మరియు 40 నిమిషాల పాటు 127,000×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది.స్పష్టం చేయబడిన సూపర్‌నాటెంట్ 3.5 kDa పొరకు (స్పెక్ట్రమ్™ థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్, UK) వర్తింపజేయబడింది మరియు 4 L డయాలసిస్ బఫర్‌కు వ్యతిరేకంగా డయలైజ్ చేయబడింది (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 m2 mMCl2, MGM, , PMSF 0.1 mM) 10 గంటలు.5 ml కేషన్ ఎక్స్ఛేంజ్ కాలమ్ (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) సమతౌల్య బఫర్ (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 m.)తో సమస్థితి చేయబడింది.టౌ లైసేట్ 0.22 μm PVDF ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడింది మరియు 1 ml/min ప్రవాహం రేటుతో కాలమ్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడింది.ఎల్యూషన్ క్రమంగా నిర్వహించబడింది, టౌ 15-30% ఎల్యూషన్ బఫర్‌తో తొలగించబడింది (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).భిన్నాలు SDS-PAGE ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు టౌ యొక్క అంచనా పరమాణు బరువుతో ఒక బ్యాండ్‌ను కలిగి ఉన్న ఏవైనా భిన్నాలు 10 kDa సెంట్రిఫ్యూజ్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించి కేంద్రీకరించబడ్డాయి మరియు వాటి కోసం 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM మరియు DTT 2 mM ఉన్న బఫర్‌తో భర్తీ చేయబడ్డాయి. చివరి ప్రోటీన్ సాంద్రత 100 μM.ప్రోటీన్ ద్రావణం 0.22 μm PVDF ఫిల్టర్ ద్వారా పంపబడుతుంది, త్వరగా స్తంభింపజేయబడుతుంది మరియు -80 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడుతుంది.ప్రొ. అల్బెర్టో బోఫీ దయతో ప్రొటీన్ K18 అందించారు.SDS-PAGE మరియు MALDI-TOF/TOF ద్వారా నిర్ధారించబడిన తయారీ యొక్క స్వచ్ఛత >95%.అలెక్సాఫ్లూర్488-మాలిమైడ్ (AF488, థర్మోఫిషర్ సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, MA, USA) లేదా TEMPOL-maleimide (టొరంటో రీసెర్చ్ కెమికల్స్, టొరంటో, కెనడా)తో వివిధ సిస్టీన్‌లు రసాయనికంగా లేబుల్ చేయబడ్డాయి.శోషణ మరియు MALDI-TOF/TOF ద్వారా నిర్ధారించబడ్డాయి.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau మరియు K18 అదే విధానాన్ని అనుసరించి Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, జర్మనీ) ఉపయోగించి 191 మరియు 322 స్థానాల్లో స్థానిక సిస్టీన్ అవశేషాలతో లేబుల్ చేయబడ్డాయి.CIDER66ని ఉపయోగించి αS మరియు Tau441 కోసం ప్రతి అవశేష మ్యాప్‌లకు నికర ఛార్జ్ రూపొందించబడింది.
సాలిడ్ పాలీ-ఎల్-లైసిన్ (సరఫరాదారు, అలమండా పాలిమర్స్ ఇంక్, హంట్స్‌విల్లే, అలబామా, USA నుండి NMR ప్రకారం pLK DP 90-110) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 నుండి 10 mM వరకు సోనిక్ ఏకాగ్రత, 5 ప్రాసెస్‌లో కరిగించబడింది. అల్ట్రాసోనిక్ నీటి స్నానంలో నిమిషాలు మరియు -20 ° C వద్ద నిల్వ చేయండి.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) మరియు FITC-dextran-500 (సిగ్మా -ఆల్డ్రిచ్, శాంట్ లూయిస్, MI, USA) నీటిలో కరిగేవి మరియు LLPS బఫర్‌లో విస్తృతంగా పంపిణీ చేయబడతాయి.డయాలసిస్ కలుషిత లవణాలను తొలగిస్తుంది.అవి 0.22 μm రంధ్రాల పరిమాణంతో సిరంజి ఫిల్టర్ ద్వారా ఫిల్టర్ చేయబడ్డాయి మరియు వాటి సాంద్రతలను రిఫ్రాక్టోమీటర్ (మెట్లర్ టోలెడో, కొలంబస్, ఒహియో, USA) ఉపయోగించి లెక్కించారు.కింది క్రమంలో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద LLPS నమూనాలు తయారు చేయబడ్డాయి: బఫర్ మరియు ఎక్స్‌ట్రూషన్ మిశ్రమంగా ఉన్నాయి మరియు 1 mM ట్రిస్(2-కార్బాక్సీథైల్) ఫాస్ఫైన్ (TCEP, కార్బోసింత్, కాంప్టన్, UK), 1 mM 2,2,2,2-(ఈథేన్- 1, 2-డైల్డినిట్రైల్) టెట్రాఅసిటిక్ యాసిడ్ (EDTA, కార్బాక్సింత్) మరియు 1% ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ (PMSF 100 mM, బెంజిమైడ్ 1 mM, ల్యూపెప్టిన్ 5 μM) మిశ్రమం.అప్పుడు αS మరియు ఫ్యూజ్డ్ పాలికేషన్‌లు (ఐచ్ఛికాలు pLK లేదా Tau) జోడించబడతాయి.థియోఫ్లావిన్-T సమయ శ్రేణి ప్రయోగాల కోసం (ThT, కార్బోసింత్, కాంప్టన్, UK), మొత్తం ThT ఏకాగ్రతను సగం αS గా ఉండేలా ఉపయోగించండి.శాంపిల్స్ సజాతీయంగా ఉన్నాయని నిర్ధారించుకోవడానికి శాంతముగా కానీ పూర్తిగా కలపండి.ఫలితాల విభాగంలో వివరించిన విధంగా ప్రతి భాగం యొక్క ఏకాగ్రత ప్రయోగం నుండి ప్రయోగానికి మారుతూ ఉంటుంది.ప్రయోగం యొక్క వ్యవధి 4 గంటలు దాటినప్పుడల్లా అజైడ్ 0.02% (w/v) సాంద్రతతో ఉపయోగించబడింది.LLPS నమూనాలను ఉపయోగించే అన్ని విశ్లేషణల కోసం, మిశ్రమాన్ని విశ్లేషణకు 5 నిమిషాల ముందు సమస్థితిలో ఉంచడానికి అనుమతించండి.లైట్ స్కాటరింగ్ విశ్లేషణ కోసం, 150 µl నమూనాలు నాన్-బైండింగ్ 96-వెల్ మైక్రోప్లేట్‌లపైకి లోడ్ చేయబడ్డాయి (µClear®, బ్లాక్, F-బాటమ్/చిమ్నీ వెల్, గ్రీనర్ బయో-వన్, Kremsmünster, ఆస్ట్రియా) మరియు అంటుకునే ఫిల్మ్‌తో కప్పబడి ఉన్నాయి.CLARIOstar ప్లేట్ రీడర్‌లో (BMG ల్యాబ్‌టెక్, ఓర్టెన్‌బర్గ్, జర్మనీ) ద్రావణం మధ్యలో 350 nm వద్ద శోషణను కొలవడం ద్వారా LLPలు పర్యవేక్షించబడ్డాయి.ప్రయోగాలు 25 ° C వద్ద మూడుసార్లు జరిగాయి, మరియు లోపాలు సగటు నుండి ప్రామాణిక విచలనం వలె లెక్కించబడ్డాయి.పలుచన దశ నమూనా సెంట్రిఫ్యూగేషన్ మరియు SDS-PAGE జెల్ విశ్లేషణ ద్వారా లెక్కించబడింది మరియు పలుచన మరియు కేంద్రీకృత దశలలోని αS భిన్నం వివిధ LLPS పరిష్కారాలలో లెక్కించబడుతుంది.1 μM AF488-లేబుల్ చేయబడిన αS కలిగి ఉన్న 100 μl LLPS నమూనాను పూర్తిగా కలపడం ద్వారా 9600×g వద్ద 30 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయడం ద్వారా తయారు చేయబడింది, ఆ తర్వాత అవక్షేపం సాధారణంగా కనిపిస్తుంది.SDS-PAGE జెల్ ఉపయోగించి ప్రోటీన్ పరిమాణీకరణ కోసం సూపర్‌నాటెంట్ యొక్క టాప్ 50 μl ఉపయోగించబడింది.కెమిడాక్ జెల్ ఇమేజింగ్ సిస్టమ్ (బయో-రాడ్ లాబొరేటరీస్, హెర్క్యులస్, CA, USA) ఉపయోగించి AF488 ఫిల్టర్‌లతో జెల్‌లు స్కాన్ చేయబడ్డాయి లేదా కూమాస్సీ స్టెయిన్‌తో స్టెయిన్ చేయబడ్డాయి మరియు తగిన ఫిల్టర్‌లతో దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.ఫలిత బ్యాండ్‌లను ImageJ వెర్షన్ 1.53i (నేషనల్ ఇన్‌స్టిట్యూట్ ఆఫ్ హెల్త్, USA) ఉపయోగించి విశ్లేషించారు.సారూప్య ఫలితాలతో రెండు వేర్వేరు ప్రయోగాలలో ప్రయోగాలు నకిలీలో జరిగాయి.
సాధారణంగా, 150 μl నమూనాలు నాన్-బైండింగ్ 96-బావి మైక్రోప్లేట్‌లకు వర్తించబడతాయి మరియు లైకా DMI6000B విలోమ మైక్రోస్కోప్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్, వెట్జ్లర్, జర్మనీ)లో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.స్పాట్ ప్రయోగాల కోసం, µ-స్లయిడ్ యాంజియోజెనిసిస్ ప్లేట్లు (Ibidi GmbH, గ్రాఫెల్ఫింగ్, జర్మనీ) లేదా 96-బావి పాలీస్టైరిన్ మైక్రోప్లేట్‌లు (కార్నింగ్ కోస్టార్ కార్ప్., యాక్టన్, మసాచుసెట్స్) కూడా ఉపయోగించబడ్డాయి.EL6000 హాలోజన్ లేదా పాదరసం మెటల్ హాలైడ్ ల్యాంప్‌లు ప్రకాశం మూలాలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి (వరుసగా BF/DIC మరియు WF ఇమేజింగ్ కోసం).WF మైక్రోస్కోపీ కోసం, నమూనాపై కాంతిని కేంద్రీకరించడానికి మరియు దానిని సేకరించడానికి 40x మాగ్నిఫికేషన్ ఎయిర్ ఆబ్జెక్టివ్ (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్, జర్మనీ) ఉపయోగించబడింది.AF488 మరియు ThT లేబుల్ చేయబడిన నమూనాల కోసం, ప్రామాణిక GFP ఫిల్టర్ సెట్‌లు, ఉత్తేజితం మరియు ఉద్గార బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌లతో ఫిల్టర్ ఎక్సైటేషన్ మరియు ఎమిషన్ వరుసగా, 460–500 nm మరియు 512–542 nm బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌లు మరియు 495 nm డైక్రోయిక్ మిర్రర్.Atto647Nతో లేబుల్ చేయబడిన నమూనాల కోసం, ఉత్తేజితం మరియు ఉద్గార బ్యాండ్‌పాస్ ఫిల్టర్‌లు వరుసగా 628–40 nm మరియు 692–40 nm కలిగిన Cy5 ఫిల్టర్‌ల ప్రామాణిక సెట్ మరియు 660 nm డైక్రోయిక్ మిర్రర్ ఉపయోగించబడింది.BF మరియు DIC మైక్రోస్కోపీ కోసం, అదే ప్రతిబింబించే కాంతి సేకరణ లక్ష్యాన్ని ఉపయోగించండి.సేకరించిన కాంతి లైకా DFC7000 CCD కెమెరాలో రికార్డ్ చేయబడింది (లైకా మైక్రోసిస్టమ్స్, జర్మనీ).ఎక్స్పోజర్ సమయం BF మరియు DIC మైక్రోస్కోపీ ఇమేజింగ్ కోసం 50 ms మరియు WF మైక్రోస్కోపీ ఇమేజింగ్ కోసం 20-100 ms.పోలిక కోసం, ThTతో అన్ని ప్రయోగాలకు ఎక్స్పోజర్ సమయం 100 ms.బిందువుల కలయికను దృశ్యమానం చేయడానికి టైమ్-లాప్స్ ప్రయోగాలు జరిగాయి, ప్రతి 100 msకు అనేక నిమిషాల పాటు చిత్రాలు సేకరించబడతాయి.చిత్ర విశ్లేషణ కోసం ImageJ (NIH, USA) ఉపయోగించబడింది.ఇలాంటి ఫలితాలతో ప్రయోగాలు మూడుసార్లు జరిగాయి.
కోలోకలైజేషన్ ప్రయోగాలు, FRAP మరియు 3D పునర్నిర్మాణం కోసం, ZEN 2 బ్లూ ఎడిషన్ (కార్ల్ జీస్ AG, ఒబెర్కోచెన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి Zeiss LSM 880 విలోమ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్‌లో చిత్రాలు పొందబడ్డాయి.50 µl నమూనాలు µ-స్లైడ్ యాంజియోజెనిసిస్ పెట్రీ వంటకాలకు (ఇబిడి జిఎమ్‌బిహెచ్, గ్రోఫెల్ఫింగ్, జర్మనీ) వర్తింపజేయబడ్డాయి, హైడ్రోఫిలిక్ పాలిమర్ (ఐబిట్రీట్)తో చికిత్స చేయబడ్డాయి మరియు 63× ఆయిల్ ఇమ్మర్షన్ ఆబ్జెక్టివ్ (ప్లాన్-అపోక్రోమాట్ 1.4/ilNA)లో అమర్చబడ్డాయి. DICలో).458 nm, 488 nm, మరియు 633 nm ఆర్గాన్ లేజర్ లైన్‌లను 0.26 µm/పిక్సెల్ రిజల్యూషన్‌తో మరియు 8 µs/పిక్సెల్ ఎక్స్‌పోజర్ సమయంతో 470–600 nm, 849 nm, ఉద్గార గుర్తింపు విండోలను ఉపయోగించి చిత్రాలు సేకరించబడ్డాయి. మరియు 638–755 nm వరుసగా ThT, AF488 మరియు Atto647Nలను దృశ్యమానం చేయడానికి ఉపయోగించబడింది.FRAP ప్రయోగాల కోసం, ప్రతి నమూనా యొక్క టైమ్-లాప్స్ ఫోటోగ్రఫీ సెకనుకు 1 ఫ్రేమ్‌లో రికార్డ్ చేయబడింది.ఇలాంటి ఫలితాలతో గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ప్రయోగాలు మూడుసార్లు జరిగాయి.అన్ని చిత్రాలు జెన్ 2 బ్లూ ఎడిషన్ సాఫ్ట్‌వేర్ (కార్ల్ జీస్ AG, ఒబెర్‌కోచెన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి విశ్లేషించబడ్డాయి.FRAP వక్రతలు సాధారణీకరించబడ్డాయి, ప్లాట్ చేయబడ్డాయి మరియు OriginPro 9.1ని ఉపయోగించి జెన్ 2 ఉపయోగించి చిత్రాల నుండి సంగ్రహించబడిన తీవ్రత/సమయ డేటాకు అమర్చబడ్డాయి.రికవరీ వక్రతలు మోనో-ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ మోడల్‌కు అమర్చబడ్డాయి, ఇది అక్విజిషన్ బ్లీచింగ్ ఎఫెక్ట్‌ను లెక్కించడానికి అదనపు ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ టర్మ్‌తో మాలిక్యులర్ డిఫ్యూజన్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకుంటుంది.మేము నామమాత్రపు బ్లీచింగ్ వ్యాసార్థం మరియు కాంగ్ మరియు ఇతరుల సమీకరణంలో వలె గతంలో నిర్ణయించిన పునరుద్ధరణ అర్ధ-జీవితాన్ని ఉపయోగించి Dని లెక్కించాము.5 35 చూపబడింది.
24 (TEMPOL-24-αS) మరియు 122 (TEMPOL-122-αS) స్థానాల్లో 4-హైడ్రాక్సీ-2,2,6,6-టెట్రామెథైల్పిపెరిడిన్-N-ఆక్సిల్ (TEMPOL)తో αS యొక్క సింగిల్ సిస్టీన్ వేరియంట్‌లు సంశ్లేషణ చేయబడ్డాయి. వరుసగా.EPR ప్రయోగాల కోసం స్పిన్ లేబులింగ్, αS గాఢత 100 μM వద్ద సెట్ చేయబడింది మరియు PEG ఏకాగ్రత 15% (w/v).వివిధ అగ్రిగేషన్ పరిస్థితుల కోసం, αS:pLK నిష్పత్తి 1:10, అయితే αS:ΔNt-Tau మరియు αS:Tau441 నిష్పత్తులు 1:1 వద్ద నిర్వహించబడ్డాయి.రద్దీ లేనప్పుడు బైండింగ్ టైట్రేషన్ ప్రయోగాల కోసం, TEMPOL-122-αS 50 μM వద్ద నిర్వహించబడుతుంది మరియు పాలీకేషన్‌లు పెరుగుతున్న సాంద్రతలలో టైట్రేట్ చేయబడ్డాయి, ప్రతి షరతును విడిగా సిద్ధం చేస్తాయి.CW-EPR కొలతలు బ్రూకర్ ELEXSYS E580 X-బ్యాండ్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌ని ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి, బ్రూకర్ ER4118 SPT-N1 రెసొనేటర్ ~9.7 GHz మైక్రోవేవ్ (SHF) పౌనఃపున్యం వద్ద పనిచేస్తుంది.ఉష్ణోగ్రత 25 ° C వద్ద సెట్ చేయబడింది మరియు ద్రవ నైట్రోజన్ క్రియోస్టాట్ ద్వారా నియంత్రించబడుతుంది.స్పెక్ట్రా అసంతృప్త పరిస్థితులలో 4 mW యొక్క MW శక్తి, 0.1 mT యొక్క మాడ్యులేషన్ వ్యాప్తి మరియు 100 kHz యొక్క మాడ్యులేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ వద్ద పొందబడింది.Tau441 లేదా ΔNt-Tau (అసలు ప్రోటీన్ సొల్యూషన్స్‌లో ఉన్నది) కలిగిన నమూనాలలో ఏజెంట్లను తగ్గించే అవశేష సాంద్రతల కారణంగా నమూనాల మధ్య స్పిన్ సాంద్రతలలో తేడాలు మరియు స్పిన్ తగ్గింపును నివారించడానికి స్పెక్ట్రల్ తీవ్రతలు సాధారణీకరించబడ్డాయి.Matlab®67లో అమలు చేయబడిన Easyspin సాఫ్ట్‌వేర్ (v. 6.0.0-dev.34)ని ఉపయోగించి ప్రదర్శించిన EPR స్పెక్ట్రల్ మోడలింగ్ ఫలితంగా g యొక్క ఇవ్వబడిన విలువలు పొందబడ్డాయి.డేటాను మోడల్ చేయడానికి ఒకటి/రెండు భాగం ఐసోట్రోపిక్ నమూనాలు ఉపయోగించబడ్డాయి.అన్ని సంకేతాలను సాధారణీకరించిన తర్వాత, సంబంధిత ప్రయోగాత్మక స్పెక్ట్రం నుండి ప్రతి అనుకరణను తీసివేయడం ద్వారా అవశేషాలు లెక్కించబడతాయి.బైండింగ్ టైట్రేషన్ విశ్లేషణ కోసం, సాధారణీకరించిన EPR స్పెక్ట్రమ్ (IIII/III) యొక్క రెండవ బ్యాండ్‌కు మూడవ బ్యాండ్ యొక్క సాపేక్ష తీవ్రత αS కు పాలికేషన్‌ల బైండింగ్‌ను పర్యవేక్షించడానికి ఉపయోగించబడింది.డిస్సోసియేషన్ స్థిరాంకం (Kd) అంచనా వేయడానికి, ఫలితంగా వక్రరేఖ n ఒకేలా మరియు స్వతంత్ర బైండింగ్ సైట్‌లను ఊహిస్తూ సుమారు నమూనాకు అమర్చబడింది.
క్రియోప్రోబ్ మరియు Z-గ్రేడియంట్‌తో కూడిన బ్రూకర్ నియో 800 MHz (1H) NMR స్పెక్ట్రోమీటర్‌ని ఉపయోగించి NMR స్పెక్ట్రోస్కోపీ ప్రయోగాలు జరిగాయి.అన్ని ప్రయోగాలు 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4లో 130–207 µM αS మరియు సంబంధిత αS/ΔNt-Tau మరియు pLK సమానమైన వాటిని ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి మరియు 15°C వద్ద ప్రదర్శించబడ్డాయి.NMR ద్వారా LPSని పర్యవేక్షించడానికి, ప్రీ-మిక్స్డ్ శాంపిల్స్‌కు 10% PEG జోడించబడింది.కెమికల్ షిఫ్ట్ పెర్టుబేషన్ ప్లాట్ (Fig. 1b) సగటు 1H మరియు 15N రసాయన మార్పులను చూపుతుంది.αS 2D1H-15N HSQC స్పెక్ట్రా మునుపటి అసైన్‌మెంట్ (BMRB ఎంట్రీ #25227) ఆధారంగా కేటాయించబడింది మరియు HNCA, HNCO మరియు CBCAcoNH యొక్క 3D స్పెక్ట్రాను రికార్డ్ చేయడం మరియు విశ్లేషించడం ద్వారా నిర్ధారించబడింది.స్వచ్ఛమైన యాదృచ్ఛిక కాయిల్ కన్ఫర్మేషన్ 68 (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5 సి)లో αS రసాయన మార్పులతో పోలిస్తే ద్వితీయ నిర్మాణ ధోరణులలో సాధ్యమయ్యే మార్పులను కొలవడానికి 13Cα మరియు 13Cβ రసాయన మార్పులు ΔNt-Tau లేదా pLK సమక్షంలో లెక్కించబడ్డాయి.R1ρ రేట్లు 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 మరియు 800 ms ఆలస్యంతో hsqctretf3gpsi ప్రయోగాలను (బ్రూకర్ లైబ్రరీ నుండి పొందినవి) రికార్డ్ చేయడం ద్వారా కొలుస్తారు మరియు ఘాతాంక విధులు వివిధ ఆలస్యాల గరిష్ట స్థాయికి సర్దుబాటు చేయబడ్డాయి. R1ρ మరియు దాని ప్రయోగాత్మక అనిశ్చితిని నిర్ణయించే సమయాలు.
రెండు-రంగు సమయ-పరిష్కార ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీ ప్రయోగాలు వాణిజ్య సమయ-పరిష్కార MT200 ఫ్లోరోసెన్స్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (PicoQuant, బెర్లిన్, జర్మనీ) ఒక సమయ-సంబంధిత సింగిల్ ఫోటాన్ లెక్కింపు (TCSPC) పరికరంతో నిర్వహించబడ్డాయి.లేజర్ డయోడ్ హెడ్ పల్సెడ్ ఇంటర్‌లీవ్డ్ ఎక్సైటేషన్ (PIE) కోసం ఉపయోగించబడుతుంది, బీమ్ సింగిల్ మోడ్ వేవ్‌గైడ్ గుండా వెళుతుంది మరియు డైక్రోయిక్ మిర్రర్ తర్వాత కొలవబడిన 481 nm మరియు 637 nm లేజర్ లైన్‌ల కోసం 10 నుండి 100 nW వరకు లేజర్ పవర్‌కు ట్యూన్ చేయబడుతుంది.ఇది సరైన ఫోటాన్ లెక్కింపు రేటును నిర్ధారిస్తుంది, ఫోటాన్ అలియాసింగ్, ఫోటోబ్లీచింగ్ మరియు సంతృప్త ప్రభావాలను నివారిస్తుంది.μ-స్లైడ్ యాంజియోజెనిసిస్ కవర్‌స్లిప్‌లు లేదా ప్లేట్లు (Ibidi GmbH, గ్రాఫెల్ఫింగ్, జర్మనీ) నేరుగా ఇమ్మర్షన్ వాటర్‌లో సూపర్ అపోక్రోమాట్ 60x NA 1.2 లెన్స్‌తో కరెక్టివ్ కాలర్‌తో (ఒలింపస్ లైఫ్ సైన్సెస్, వాల్తామ్, USA) ఉంచబడ్డాయి.488/640 nm డైక్రోయిక్ మిర్రర్ (సెమ్‌రాక్, లేక్ ఫారెస్ట్, IL, USA) ప్రధాన బీమ్ స్ప్లిటర్‌గా ఉపయోగించబడింది.ఫోకస్ చేయని రేడియేషన్ 50 మైక్రాన్ల వ్యాసం కలిగిన రంధ్రం ద్వారా నిరోధించబడుతుంది, అప్పుడు కేంద్రీకృత రేడియేషన్ 50/50 బీమ్ స్ప్లిటర్ ద్వారా 2 డిటెక్షన్ పాత్‌లుగా విభజించబడింది.బ్యాండ్‌పాస్ ఉద్గార ఫిల్టర్‌లు (సెమ్‌రాక్, లేక్ ఫారెస్ట్, IL, USA) గ్రీన్ డై (AF488) కోసం 520/35 మరియు రెడ్ డై (Atto647N) కోసం 690/70 డిటెక్టర్ ముందు ఉపయోగించబడ్డాయి.సింగిల్-ఫోటాన్ అవలాంచ్ డయోడ్‌లు (SPAD) (మైక్రో ఫోటాన్ డివైసెస్, బోల్జానో, ఇటలీ) డిటెక్టర్‌లుగా ఉపయోగించబడ్డాయి.వాణిజ్యపరంగా లభించే సింఫోటైమ్ 64 సాఫ్ట్‌వేర్ (పికోక్వాంట్ జిఎమ్‌బిహెచ్, బెర్లిన్, జర్మనీ) ఉపయోగించి డేటా సేకరణ మరియు విశ్లేషణ రెండూ జరిగాయి.
μ-స్లైడ్ యాంజియోజెనిసిస్ బావులకు (ఇబిడి జిఎమ్‌బిహెచ్, గ్రాఫెల్ఫింగ్, జర్మనీ) యాభై మైక్రోలీటర్ల ఎల్‌ఎల్‌పిఎస్ నమూనాలు వర్తింపజేయబడ్డాయి.ఫలిత చిత్రాలు సస్పెండ్ చేయబడిన బిందువుల కోసం సరైన లక్ష్యం పని దూరం కోసం బాగా దిగువ నుండి 20 µm వరకు మరియు కనీసం 0.25 µm/పిక్సెల్ అక్షసంబంధ రిజల్యూషన్‌తో మరియు 400 µs/పిక్సెల్ ఆలస్యం సమయంతో తెప్పలు మరియు చుక్కల కోసం ~1 µm వరకు కేంద్రీకరించబడతాయి.ప్రతి ఛానెల్‌కు సగటు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్ ఇంటెన్సిటీ (PBG, మీన్ + 2σ) ఆధారంగా ఇంటెన్సిటీ థ్రెషోల్డ్‌ని వర్తింపజేయడం ద్వారా డేటాను ఎంచుకోండి, తద్వారా ద్రవ ప్రోటీన్ బిందువులు, తెప్పలు లేదా మచ్చలు మాత్రమే ఎంపిక చేయబడతాయి, చెదరగొట్టబడిన దశ నుండి ఏదైనా మూలాన్ని ఫిల్టర్ చేస్తుంది.ప్రతి ఛానెల్‌లోని ప్రతి జాతి (τ) జీవితకాలాన్ని విశ్లేషించడానికి (AF488 కోసం ఆకుపచ్చ, “g” మరియు ఎరుపు, Atto647N కోసం “r”), మేము బిందువులు, తెప్పలు లేదా మచ్చలు (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1) కలిగి ఉన్న ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతాలను (ROIలు) ఎంచుకున్నాము. )8b) మరియు ప్రతి ఛానెల్‌లో టెయిల్-ఫిట్ విశ్లేషణ మరియు రెండు-భాగాల క్షీణత నమూనాను ఉపయోగించి వారి జీవితకాల క్షీణతను (బిందువులు, తెప్పలు లేదా మచ్చల కోసం వరుసగా τD, τR మరియు τP అనుబంధ అంజీర్ 8c చూడండి) అమర్చడం ద్వారా వాటిని పొందారు.τ నుండి సగటు τ .మల్టీ-ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ ఫిట్ కోసం చాలా తక్కువ ఫోటాన్‌లను ఉత్పత్తి చేసే ROIలు విశ్లేషణ నుండి మినహాయించబడ్డాయి.ఉపయోగించిన కటాఫ్ తెప్పలు మరియు చుక్కల కోసం <104 ఫోటాన్లు మరియు చుక్కల కోసం 103.బిందువులు తక్కువ థ్రెషోల్డ్‌ను కలిగి ఉంటాయి, ఎందుకంటే ఇమేజ్ ఫీల్డ్‌లోని బిందువులు సాధారణంగా చిన్నవి మరియు తక్కువ సంఖ్యలో ఉంటాయి కాబట్టి, అధిక తీవ్రత విలువలతో క్షయం వక్రతలను పొందడం కష్టం.ఫోటాన్ సంచిత పరిమితి (> 500 గణనలు/పిక్సెల్‌కి సెట్ చేయబడింది) కంటే ఎక్కువ ఫోటాన్ గణనలతో కూడిన ROIలు కూడా విశ్లేషణ కోసం విస్మరించబడ్డాయి.ఆసక్తి ఉన్న ప్రాంతం నుండి పొందిన తీవ్రత క్షీణత వక్రరేఖను సేవా జీవితం ప్రారంభం నుండి గరిష్టంగా 90% (గరిష్ట క్షయం తర్వాత కొంచెం) తీవ్రతతో సరిపోల్చండి సెట్టింగ్‌లు సాపేక్ష సమయ విండో తెప్పలు మరియు మచ్చల కోసం 25 నుండి 50 ROI మరియు డ్రాప్‌ల కోసం 15-25 ROI విశ్లేషించబడింది, కనీసం 3 స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి రికార్డ్ చేయబడిన 4 కంటే ఎక్కువ ప్రతిరూపాల నుండి ఎంపిక చేయబడిన చిత్రాలు.జాతుల మధ్య లేదా కోసర్వేట్ వ్యవస్థల మధ్య గణాంక వ్యత్యాసాలను అంచనా వేయడానికి రెండు-తోక గల t-పరీక్షలు ఉపయోగించబడ్డాయి.జీవితకాలం (τ) యొక్క పిక్సెల్-బై-పిక్సెల్ విశ్లేషణ కోసం, ప్రతి ఛానెల్ కోసం ఫీల్డ్‌లో జీవితకాలం యొక్క మొత్తం అటెన్యుయేషన్ లెక్కించబడుతుంది మరియు 2/3-కాంపోనెంట్ ఎక్స్‌పోనెన్షియల్ అటెన్యుయేషన్ మోడల్ యొక్క ఉజ్జాయింపు నిర్వహించబడింది.ప్రతి పిక్సెల్‌కు జీవితకాల అటెన్యుయేషన్ మునుపు లెక్కించిన τ విలువలను ఉపయోగించి అమర్చబడింది, ఫలితంగా ఒక సూడోకలర్ FLIM ఫిట్ ఇమేజ్ ఏర్పడుతుంది.టైల్-ఫిట్ లైఫ్‌టైమ్ పరిధి ఒకే ఛానెల్‌లోని అన్ని చిత్రాలలో ఒకే విధంగా ఉంటుంది మరియు ప్రతి క్షీణత నమ్మదగిన ఫిట్‌ను అందించడానికి తగినంత ఫోటాన్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.FRET విశ్లేషణ కోసం, 100 ఫోటాన్‌ల తక్కువ తీవ్రత థ్రెషోల్డ్‌ని వర్తింపజేయడం ద్వారా పిక్సెల్‌లు ఎంపిక చేయబడ్డాయి, ఇది 11 ఫోటాన్‌ల బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్ (FBG) సగటును కలిగి ఉంటుంది.ప్రతి ఛానెల్ యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత ప్రయోగాత్మకంగా నిర్ణయించబడిన దిద్దుబాటు కారకాల ద్వారా సరిదిద్దబడింది: 69 స్పెక్ట్రల్ క్రాస్‌స్టాక్ α 0.004, ప్రత్యక్ష ఉత్తేజితం β 0.0305, గుర్తింపు సామర్థ్యం γ 0.517.పిక్సెల్ స్థాయిలో FRET సామర్థ్యం క్రింది సమీకరణాన్ని ఉపయోగించి లెక్కించబడుతుంది:
ఇక్కడ FDD అనేది దాత (ఆకుపచ్చ) ఛానెల్‌లో గమనించిన ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత, FDA అనేది పరోక్ష ఉత్తేజితం కింద అంగీకరించే (ఎరుపు) ఛానెల్‌లో గమనించిన ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత మరియు FAA అనేది ప్రత్యక్ష ఉత్తేజిత (ఎరుపు) ఛానెల్‌లో గమనించిన ఫ్లోరోసెన్స్ తీవ్రత ( PIE).ఛానల్‌లో ఫ్లోరోసెన్స్ ఇంటెన్సిటీ పప్పులు గమనించబడతాయి).
LLPS బఫర్‌లో 25 µM లేబుల్ చేయని మోనోమెరిక్ Tau441 (25 µM αSతో లేదా లేకుండా) కలిగి ఉన్న 100 µl LLPS రియాక్షన్ సొల్యూషన్‌లను LLPS బఫర్‌లో (పైన అనుబంధంగా) ఉంచండి సమతౌల్యం.10 నిమిషాలలోపు.గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 48 గంటల పొదిగే తర్వాత, ప్రోటీన్ తెప్పలు మరియు మచ్చలు ఉన్నట్లు నిర్ధారించబడింది.తర్వాత బావుల నుండి తెప్పల మీద ఉన్న ద్రవాన్ని జాగ్రత్తగా తీసివేసి, ఆపై 50 L డిస్సోసియేషన్ బఫర్ (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) వేసి 10 నిమిషాలు పొదిగించండి.అధిక ఉప్పు సాంద్రత అవశేష PEG కారణంగా LLPS పునరావృతం కాదని నిర్ధారిస్తుంది మరియు ఎలెక్ట్రోస్టాటిక్ ఇంటరాక్షన్‌ల ద్వారా మాత్రమే ఏర్పడే ప్రోటీన్ అసెంబ్లీలు విడదీయబడతాయి.బావి దిగువన మైక్రోపిపెట్ చిట్కాతో జాగ్రత్తగా స్క్రాప్ చేయబడింది మరియు ఫలిత పరిష్కారం ఖాళీ పరిశీలన బావికి బదిలీ చేయబడింది.1 గంటకు 50 μM ThTతో నమూనాలను పొదిగిన తరువాత, వివిక్త మచ్చల ఉనికిని WF మైక్రోస్కోపీ ద్వారా తనిఖీ చేశారు.pH 7.4తో PBSలో 70-µM αS ద్రావణంలో 300 µl, 37 °C వద్ద సోడియం అజైడ్ 0.01% మరియు ఆర్బిటల్ షేకర్‌పై 200 rpmతో 300 µlని పొదిగించడం ద్వారా సోనికేటెడ్ αS ఫైబ్రిల్స్‌ను సిద్ధం చేయండి.పరిష్కారం తర్వాత 30 నిమిషాలకు 9600×g వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది, గుళిక PBS pH 7.4లో మళ్లీ అమర్చబడింది మరియు సోనికేట్ చేయబడింది (1 నిమిషం, 50% చక్రం, వైబ్రా-సెల్ VC130 సోనికేటర్‌లో 80% వ్యాప్తి, సోనిక్స్, న్యూటన్, USA) ఫైబ్రిల్ నమూనాలు చిన్న ఫైబ్రిల్స్ యొక్క సాపేక్షంగా ఏకరీతి పరిమాణం పంపిణీతో.
PIE మోడ్‌ని ఉపయోగించి FLIM-FRET మైక్రోస్కోపీ ప్రయోగాల కోసం ఉపయోగించిన అదే MT200 సమయ-పరిష్కార ఫ్లోరోసెంట్ కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ (Pico-Quant, Berlin, Germany)పై FCS/FCCS విశ్లేషణ మరియు రెండు-రంగు యాదృచ్చిక గుర్తింపు (TCCD) ప్రదర్శించబడ్డాయి.ఈ ప్రయోగాల కోసం లేజర్ శక్తి 6.0 µW (481 nm) మరియు 6.2 µW (637 nm)కి జోడించబడింది.ఈ లేజర్ శక్తుల కలయిక సరైన గణన రేట్లను సాధించేటప్పుడు మరియు ఫోటోబ్లిచింగ్ మరియు సంతృప్తతను నివారించేటప్పుడు ఉపయోగించే ఫ్లోరోఫోర్‌ల జతలకు సమానమైన ప్రకాశాన్ని ఉత్పత్తి చేయడానికి ఎంపిక చేయబడింది.వాణిజ్యపరంగా లభించే SymfoTime64 వెర్షన్ 2.3 సాఫ్ట్‌వేర్ (PicoQuant, Berlin, Germany) ఉపయోగించి డేటా సేకరణ మరియు విశ్లేషణ రెండూ జరిగాయి.
LLPSని ఉపయోగించి పొందిన వివిక్త αS/Tau కంకరల నమూనాలు సముచితమైన మోనోమోలిక్యులర్ ఏకాగ్రతకు ఐసోలేషన్ బఫర్‌లో కరిగించబడతాయి (సాధారణంగా 1:500 పలుచన, కోసర్వేట్ నమూనాల నుండి వేరుచేయబడినప్పుడు కంకరలు ఇప్పటికే తక్కువ సాంద్రతలో ఉంటాయి).1 mg/mL గాఢతతో BSA ద్రావణంతో ముందుగా పూసిన కవర్‌లిప్‌లకు (కార్నింగ్, USA) నమూనాలు నేరుగా వర్తింపజేయబడ్డాయి.
ఆకుపచ్చ మరియు ఎరుపు ఛానెల్‌లలోని PIE-smFRET విశ్లేషణ కోసం, మోనోమెరిక్ సంఘటనల వల్ల కలిగే తక్కువ తీవ్రత సంకేతాలను ఫిల్టర్ చేయడానికి 25 ఫోటాన్‌ల తక్కువ తీవ్రత థ్రెషోల్డ్ వర్తించబడింది (వివిక్త కంకరలతో పోలిస్తే మోనోమర్‌లు సమగ్ర నమూనాలను మించిపోయాయని గమనించండి).ఈ థ్రెషోల్డ్ ప్రత్యేకంగా విశ్లేషణ కోసం కంకరలను ఎంచుకోవడానికి స్వచ్ఛమైన మోనోమర్ నమూనాల విశ్లేషణ నుండి పొందిన మోనోమెరిక్ αS యొక్క సగటు తీవ్రత కంటే ఐదు రెట్లు లెక్కించబడుతుంది.PIE డ్రైవ్ సర్క్యూట్, TSCPC డేటా సేకరణతో పాటు, బ్యాక్‌గ్రౌండ్ మరియు స్పెక్ట్రల్ క్రాస్‌స్టాక్‌ను తొలగించడంలో సహాయపడే జీవితకాల వెయిటింగ్ ఫిల్టర్ యొక్క అప్లికేషన్‌ను ప్రారంభించింది.పై థ్రెషోల్డ్‌లను ఉపయోగించి ఎంచుకున్న ఫ్లేర్ ఇంటెన్సిటీ, బఫర్-ఓన్లీ శాంపిల్స్ యొక్క తీవ్రత/బిన్‌కు వ్యతిరేకంగా సంభవించిన హిస్టోగ్రామ్‌ల నుండి నిర్ణయించబడిన సగటు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ సిగ్నల్‌ని ఉపయోగించి సరిదిద్దబడింది.పెద్ద కంకరలతో అనుబంధించబడిన బర్స్ట్‌లు సాధారణంగా టైమ్ ట్రేస్‌లో అనేక వరుస డబ్బాలను ఆక్రమిస్తాయి (1 msకి సెట్ చేయబడింది).ఈ సందర్భాలలో, గరిష్ట బలం యొక్క బిన్ ఎంపిక చేయబడింది.FRET మరియు స్టోయికియోమెట్రిక్ విశ్లేషణ కోసం, సిద్ధాంతపరంగా నిర్ణయించబడిన గామా కారకం γ (0.517) ఉపయోగించబడింది.ఉపయోగించిన ఉత్తేజిత లేజర్ పవర్‌లో స్పెక్ట్రల్ క్రాస్‌స్టాక్ మరియు డైరెక్ట్ ఎక్సైటేషన్ కంట్రిబ్యూషన్‌లు చాలా తక్కువగా ఉంటాయి (ప్రయోగాత్మకంగా నిర్ణయించబడతాయి).పేలుడులో FRET యొక్క సామర్థ్యం మరియు స్టోయికియోమెట్రీ క్రింది విధంగా లెక్కించబడుతుంది.