347 స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాయిల్డ్ ట్యూబ్ కెమికల్ కాంపోనెంట్, క్రాస్-లింక్డ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (CLMS)ని ఉపయోగించి నవల ఇంటర్‌ఫెరాన్-రెస్పాన్సివ్ హ్యూమన్ ల్యూకోసైట్ యాంటిజెన్-A (HLA-A) చాపెరోన్ ప్రోటీన్‌ల గుర్తింపు

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు పరిమిత CSS మద్దతుతో బ్రౌజర్ సంస్కరణను ఉపయోగిస్తున్నారు.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతాము.
స్లైడర్‌లు ఒక్కో స్లయిడ్‌కు మూడు కథనాలను చూపుతున్నాయి.స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి వెనుక మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ప్రతి స్లయిడ్ ద్వారా తరలించడానికి చివర ఉన్న స్లయిడ్ కంట్రోలర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.

ఉత్పత్తి వివరణ

స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ 347L కాయిల్ ట్యూబ్‌లు, స్టీల్ గ్రేడ్: SS347L

ఇంటర్ఫెరాన్ సిగ్నలింగ్ వ్యవస్థ పర్యావరణం నుండి అనేక రకాల వ్యాధికారక మరియు అంతర్గత రోగలక్షణ సంకేతాలకు బలమైన సైటోకిన్ ప్రతిస్పందనను ప్రేరేపిస్తుంది, దీని ఫలితంగా ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌ల ఉపసమితులు ప్రేరేపించబడతాయి.ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరిత ప్రోటీన్‌ల డొమైన్‌లో కొత్త ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను గుర్తించడానికి మేము DSS-మెడియేటెడ్ క్రాస్-లింక్ మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (CLMS)ని వర్తింపజేసాము.ఊహించిన ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌లతో పాటు, MX1, USP18, OAS3 మరియు STAT1 వంటి కానానికల్ ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌ల యొక్క నవల ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ మరియు ఇంట్రామోలెక్యులర్ క్రాస్-లింక్డ్ అడక్ట్‌లను కూడా మేము గుర్తించాము.కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్‌ని ఉపయోగించి HLA-A ప్రోటీన్‌లు (H2BFS-HLA-A-HMGA1) రూపొందించిన ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపిత ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌ల నవల సెట్ యొక్క ఆర్తోగోనల్ ధ్రువీకరణపై మేము దృష్టి సారించాము మరియు మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ మోడలింగ్‌ని ఉపయోగించి వారి తదుపరి అధ్యయనం.ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్ యొక్క కన్ఫర్మేషనల్ డైనమిక్స్ యొక్క మోడలింగ్ CLMS ఫలితాలలో గుర్తించబడిన పరస్పర చర్యలను ప్రతిబింబించే అనేక పరస్పర సైట్‌లను వెల్లడించింది.కలిసి, మేము ఇంటర్ఫెరాన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన కొత్త సిగ్నలింగ్ కాంప్లెక్స్‌లను గుర్తించడానికి CLMS యొక్క పైలట్ అధ్యయనాన్ని అందిస్తున్నాము మరియు కణితి సూక్ష్మ వాతావరణంలో ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యల యొక్క కొత్త డైనమిక్‌లను గుర్తించడానికి CLMS యొక్క విస్తృత ఉపయోగం కోసం ఎదురుచూస్తున్నాము.
అనుకూల రోగనిరోధక ప్రతిస్పందన ప్రారంభమయ్యే ముందు, హోస్ట్ యొక్క సహజమైన రక్షణ వ్యవస్థ ఇంటర్‌ఫెరాన్‌లు (IFNలు) అని పిలువబడే స్రవించే ఆల్ఫా-హెలికల్ సైటోకిన్‌ల కుటుంబం ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించిన యాంటీమైక్రోబయల్ ప్రతిస్పందనను మౌంట్ చేస్తుంది.రకం I IFN తరగతులు IFNα మరియు IFNβ యాంటీవైరల్, ప్రోపోప్టోటిక్, ప్రోఇన్‌ఫ్లమేటరీ మరియు యాంటీప్రొలిఫెరేటివ్ స్టేట్‌లతో సహా సెల్యులార్ ప్రతిస్పందనలను సక్రియం చేస్తాయి.మానవులలో, IFNα యొక్క 13 ఉపరకాలు అంటారు, అన్నీ క్రోమోజోమ్ 91పై సమూహంగా ఉంటాయి. ఆశ్చర్యకరంగా, IFNα2 మాత్రమే వైద్యపరమైన ఉపయోగం కోసం అధ్యయనం చేయబడింది.ఇటీవల, IFNα యొక్క ఇతర ఉప రకాలపై పరిశోధనపై ప్రత్యేక శ్రద్ధ చూపబడింది.కానానికల్ IFNα2 సబ్టైప్‌తో పోలిస్తే HBV2 మరియు HIV-13,4 రెప్లికేషన్‌లను నియంత్రించడంలో IFNα14 అత్యంత ప్రభావవంతమైన ఐసోఫామ్‌లలో ఒకటి అని ఇటీవలి అధ్యయనం చూపించింది.
యాక్టివేటెడ్ టైప్ I ఇంటర్ఫెరాన్ రిసెప్టర్ కాంప్లెక్స్‌లు (IFNAR1 మరియు IFNAR2) జానస్ కినాసెస్ TYK2 మరియు JAK15,6 మధ్యవర్తిత్వం వహించిన సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌డక్షన్ క్యాస్కేడ్‌ను ప్రేరేపిస్తాయని నిర్ధారించబడింది.SH2 డొమైన్-మధ్యవర్తిత్వ హెటెరోడైమైరైజేషన్‌ను ప్రారంభించడానికి టైరోసిన్ అవశేషాలపై ఈ జానస్ కినాసెస్ ఫాస్ఫోరైలేట్ సిగ్నల్ ట్రాన్స్‌డ్యూసర్‌లు మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ ప్రోటీన్ యాక్టివేటర్‌లు (STAT1 మరియు STAT2).తదనంతరం, IRF9 STAT హెటెరోడైమర్‌లను బంధిస్తుంది, ఇది IFN-ప్రేరేపిత కారకం 3 జన్యువు (ISGF3) యొక్క ట్రిమెరిక్ కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరుస్తుంది, ఇది కేంద్రకంలోకి మారుతుంది మరియు 2000 కంటే ఎక్కువ ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపిత జన్యువుల (ISGs,8,6,5) ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది.
ISGలు సహజమైన రోగనిరోధక వ్యవస్థకు వెన్నెముకగా ఉంటాయి, ముఖ్యంగా వైరల్ దాడికి ప్రతిస్పందనగా.వైరల్ ఇన్‌ఫెక్షన్‌కు వ్యతిరేకంగా రక్షణ యొక్క మొదటి వరుస వలె, కణాలు విస్తృతమైన జీవసంబంధ కార్యకలాపాలతో సెల్యులార్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క విస్తృతమైన పరస్పర చర్యలను వేగంగా అమలు చేస్తాయి.ఈ ప్రోటీన్‌లలో నమూనా గుర్తింపు గ్రాహకాలు, సిగ్నలింగ్ అణువులు, ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు మరియు ప్రత్యక్ష యాంటీవైరల్ ఫంక్షన్‌లతో కూడిన ప్రోటీన్‌లు, అలాగే రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనల యొక్క ప్రతికూల నియంత్రకాలు ఉన్నాయి.ISG యాక్టివిటీపై చాలా సమాచారం ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ స్క్రీన్‌లు10,11 లేదా జీన్ సైలెన్సింగ్ టెక్నిక్స్ (siRNA, RNAi మరియు CRISPR)12,13 ఉపయోగించి ఫంక్షనల్ స్క్రీన్‌ల నుండి వస్తుంది, ఇందులో వ్యక్తిగత ISGలు వ్యక్తీకరించబడతాయి లేదా నిరోధించబడతాయి మరియు వాటి కార్యాచరణ వివిధ వైరస్‌లపై పరీక్షించబడుతుంది.ఈ అధ్యయనాలు వ్యక్తిగత ISGల యొక్క యాంటీవైరల్ లక్షణాలను నిర్ణయించినప్పటికీ, ప్రతి ISG యొక్క అంతర్లీన పరమాణు విధానాలు ఎక్కువగా తెలియవు.పూర్తి కార్యాచరణను నిర్ధారించడానికి అనేక ప్రోటీన్లు ఒకటి లేదా అంతకంటే ఎక్కువ సైటోకిన్‌లతో సంకర్షణ చెందుతాయని సాధారణంగా అంగీకరించబడింది, కాబట్టి ISGలు నేరుగా సంకర్షణ చెందుతాయి లేదా వాటి పరస్పర చర్యలు సెల్యులార్ ప్రోటీన్‌ల ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం వహించబడతాయి.ఉదాహరణకు, ఇటీవలి ఫోటోక్రాస్‌లింక్డ్ ప్రోటీమిక్స్ అధ్యయనం ATPase VCP/p97ని ప్రధాన IFITM3 పరస్పర భాగస్వామిగా గుర్తించింది, దీని నిరోధం వైరల్ కణాలతో IFITM3 యొక్క లైసోసోమల్ సార్టింగ్, టర్నోవర్ మరియు కోట్రాన్స్‌పోర్ట్‌లో లోపాలకు దారితీస్తుంది 14 .ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ఉపయోగించి, కొలెస్ట్రాల్-మధ్యవర్తిత్వ వైరల్ పరిపక్వతకు మధ్యవర్తిత్వం వహించే IFITM1/2/3తో పరస్పర భాగస్వామిగా VAPA అనే ​​వెసికిల్-అనుబంధ ప్రోటీన్‌ని మేము గుర్తించాము మరియు ఈస్ట్ టూ-హైబ్రిడ్ వ్యవస్థను ఉపయోగించి మరొక అధ్యయనం ద్వారా ఇది నిర్ధారించబడింది.శాస్త్రీయ మద్దతు 15, 16.
ఇన్ఫెక్షన్ మరియు ప్రాణాంతక పరివర్తనను అణచివేయడంలో ప్రాథమిక జీవ ప్రక్రియ యాంటిజెన్ ప్రెజెంటేషన్, ఇది ప్రధాన హిస్టోకాంపాబిలిటీ కాంప్లెక్స్ (MHC) అణువులచే మధ్యవర్తిత్వం చేయబడింది.పెప్టైడ్‌లు (8-12 అమైనో ఆమ్లాల పొడవు) క్లీవ్డ్, ప్రీమెచ్యూర్ టర్మినేట్ లేదా మిస్‌ఫోల్డ్ ప్రొటీన్‌లు MHC-I హెటెరోడైమర్‌లోకి లోడ్ చేయబడతాయి (MHC-I హెవీ మరియు లైట్ చైన్‌లను కలిగి ఉంటుంది, దీనిని β-2-మైక్రోగ్లోబులిన్; β2M అని పిలుస్తారు) 17,18 .ఫలితంగా స్థిరమైన MHC-I ట్రిమర్‌లు సెల్ ఉపరితలానికి రవాణా చేయబడతాయి, ఇక్కడ అవి కణాంతర పెప్టైడ్‌లను CD8+ T కణాలకు (సైటోటాక్సిక్ T కణాలు) అందజేస్తాయి.T కణాలు ఈ వ్యాధికారకాలను మరియు కణితి-నిర్దిష్ట యాంటిజెన్‌ను మోసే కణాలను గుర్తించి నాశనం చేస్తాయి.పర్యవసానంగా, రోగనిరోధక నిఘాను నివారించడానికి వ్యాధికారక మరియు కణితి కణాలు తరచుగా యాంటిజెన్ ప్రదర్శన ప్రక్రియను అణిచివేస్తాయి.అదనంగా, MHC-I 40-90% మానవ కణితులలో నియంత్రించబడదు మరియు తరచుగా పేద రోగ నిరూపణతో సంబంధం కలిగి ఉంటుంది.
వ్యాధికారక కారకాలకు ప్రతిస్పందించడంలో పాల్గొన్న జన్యువులు విశ్రాంతి స్థితి మరియు క్రియాశీల లిప్యంతరీకరణ స్థితి మధ్య త్వరగా మారాలి.అందువల్ల, ప్రమోటర్ క్రోమాటిన్ 20,21 యొక్క పునర్నిర్మాణం మరియు మార్పులతో సహా, తక్కువ వ్యవధిలో అధిక IFN డిమాండ్‌కు ప్రతిస్పందనలో అనేక సెల్యులార్ ప్రోటీన్‌లు పాల్గొంటాయని ఊహిస్తారు.చాలా అధ్యయనాలు IFN సమక్షంలో వ్యక్తిగత ISG ప్రోటీన్ భాగస్వాముల గుర్తింపుపై దృష్టి సారించాయి.మోడల్ సెల్ సిస్టమ్స్‌లోని అనేక ప్రోటీమిక్ మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ అధ్యయనాలు సెల్యులార్ ల్యాండ్‌స్కేప్‌పై IFN ప్రభావాన్ని విశదీకరించాయి.అయినప్పటికీ, ఇంటర్‌ఫెరాన్‌లచే ప్రేరేపించబడిన డైనమిక్స్‌పై అవగాహన పెరుగుతున్నప్పటికీ, ISGల ప్రమేయం గురించి మాకు ఇంకా చాలా తక్కువ తెలుసు.ఇంటర్ఫెరాన్ సిగ్నలింగ్ యొక్క సంక్లిష్టత మరియు సమయ-ఆధారిత డైనమిక్‌లను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, రెండు ప్రశ్నలు తలెత్తుతాయి: (i) ఫాస్ట్ సిగ్నలింగ్‌లో పాల్గొన్న మల్టీప్రొటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను స్థిరీకరించడం మరియు ట్రాప్ చేయడం సాధ్యమేనా మరియు (ii) ఈ పరస్పర చర్యలను 3D స్పేస్‌లోకి మ్యాప్ చేయవచ్చా?
ఈ సమస్యలను పరిష్కరించడానికి, IFNα- ప్రేరిత ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్ మరియు దాని డైనమిక్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి మేము మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (CLMS)తో పాటు డిస్సిసినిమైడ్ సబ్‌రేట్-మెడియేటెడ్ కెమికల్ క్రాస్-లింకింగ్ (DSS)ని అమలు చేసాము.వివోలో ప్రోటీన్లు మరియు/లేదా ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క ప్రాక్సిమల్ అవశేషాల మధ్య సమయోజనీయ బంధాలను DSS జోడిస్తుంది.తదుపరి MS విశ్లేషణ ఒక నిర్దిష్ట ప్రోటీన్‌లోని ప్రాంతాల యొక్క ప్రాదేశిక సామీప్యాన్ని ప్రతిబింబించే నిర్దిష్ట క్రాస్‌లింకింగ్ సైట్‌లను వెల్లడిస్తుంది, వీటిని అంతర్గత అనుసంధానాలు అని పిలుస్తారు లేదా ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లలోని సబ్‌యూనిట్‌లను ఇంటర్‌రిలేషన్‌షిప్ అని పిలుస్తారు.ఈ విధానాన్ని ఉపయోగించి, మేము అనేక నవల ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను అలాగే ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరిత మల్టీప్రొటీన్ ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్‌లను గుర్తించాము.ఈ కొత్త పరస్పర చర్యల యొక్క ఉపసమితిని మరింత పరీక్షించడం ద్వారా, H2BFS (H2B హిస్టోన్-రకం FS; ఇకపై H2Bగా సూచిస్తారు) మరియు MDN1 HLA-Aకి బంధన భాగస్వాములుగా పనిచేస్తాయని మేము నిరూపిస్తున్నాము.
ఫ్లో-1 కణాలు అన్నవాహిక అడెనోకార్సినోమా యొక్క విట్రో మోడళ్లలో బాగా తెలిసినవి, ఎందుకంటే అవి అన్నవాహిక కణితుల యొక్క ముఖ్య లక్షణాలను అనుకరిస్తాయి22,23.అయినప్పటికీ, అన్ని కణితులు ఇమ్యునోజెనిక్ కావు మరియు ఇంటర్‌ఫెరాన్ చికిత్సకు ఫ్లో-1 కణాలు ప్రతిస్పందిస్తాయో లేదో తెలుసుకోవడానికి, మేము ఫ్లో-1 కణాలను 10 ng/ml IFNαతో 72 గంటల పాటు చికిత్స చేసాము.Flo-1 కణాలు pSTAT1 మరియు IRF1 యొక్క ప్రారంభ ప్రేరణను చూపించాయి, చికిత్స తర్వాత 2 గంటలు ప్రారంభించి 72 గంటల పాటు కొనసాగుతుంది, IRF1 యొక్క స్థిర స్థాయిలలో సమయ-ఆధారిత తగ్గుదల (మూర్తి 1A).ISGలు (MX1, IFITM1, OAS1/2, మరియు ISG15) IFNα (Figure 1A)కి క్లాసిక్ మధ్య మరియు చివరి దశ ప్రతిస్పందనలను అనుకరిస్తూ 6 గంటల తర్వాత బలంగా ప్రేరేపించబడినట్లు కనుగొనబడింది.మొత్తంగా, ఈ డేటా ఇంటర్ఫెరాన్ ప్రతిస్పందనలను అధ్యయనం చేయడానికి ఈ సెల్యులార్ మోడల్‌ను ఉపయోగించవచ్చని సూచిస్తుంది.
IFNα చికిత్స తర్వాత ఫ్లో-1 కణాలలో డిఫరెన్షియల్ ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ ప్రతిస్పందనలు.(ఎ) 2, 6, 24, 48 మరియు 72 గంటల పాటు 10 ng/ml IFNαతో చికిత్స చేయబడిన Flo-1 కణాలలో ప్రోటీన్ వ్యక్తీకరణ సూచించిన ISG ప్రతిరోధకాలను ఉపయోగించి ఇమ్యునోబ్లోట్ ద్వారా విశ్లేషించబడింది.(B) సూచించిన సమయాలు మరియు సాంద్రతల కోసం DSSతో క్రాస్-లింక్ చేసిన తర్వాత మొత్తం సెల్ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్‌ల కూమాస్సీ బ్లూ స్టెయిన్డ్ SDS-PAGE జెల్‌లు.(సి) ప్రోటీన్ క్రాస్-లింకింగ్ స్థాయిని అంచనా వేయడానికి అదే నమూనాల నుండి p53(DO-1) యాంటీబాడీతో ప్రతినిధి ఇమ్యునోబ్లాట్‌ను పరిశీలించారు.
ఇన్ సిటు ప్రొటీన్ ఇంటరాక్షన్ ల్యాండ్‌స్కేప్‌ను క్యాప్చర్ చేయడానికి, మేము దాని అధిక మెమ్బ్రేన్ పారగమ్యత మరియు సాపేక్షంగా తక్కువ ప్రతిచర్య సమయం కారణంగా విస్తృతంగా ఉపయోగించే క్రాస్-లింకింగ్ ఏజెంట్ అయిన DSSని ఉపయోగించాము.తక్కువ ప్రతిచర్య సమయం క్రాస్‌లింక్డ్ ప్రొటీన్‌ల పెద్ద కంకర ఏర్పడకుండా నిరోధించడానికి సహాయపడుతుంది, తద్వారా క్రాస్‌లింకర్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని కాపాడుతుంది.సరైన DSS ఏకాగ్రతను నిర్ణయించడానికి మరియు ఓవర్-క్రాస్‌లింక్‌ను నివారించడానికి, మేము మొదట కణాలను వరుసగా 5, 10, 5 మరియు 30 నిమిషాల పాటు 5, 2.5 మరియు 1 mM DSSకి బహిర్గతం చేసాము మరియు Coomassie-stained SDS-PAGE ద్వారా లైసేట్‌లను విశ్లేషించాము. (డేటా చూపబడలేదు) .కణ లైసేట్లు అత్యల్ప ఏకాగ్రత వద్ద మరియు అతి తక్కువ సమయ బిందువు వద్ద అత్యంత క్రాస్-లింక్డ్‌గా కనిపిస్తాయి.అందువల్ల, DSS 5 నిమిషాలకు 1, 0.5 మరియు 0.1 mMకి టైట్రేట్ చేయబడింది (మూర్తి 1B).5 నిమిషాల పాటు 0.5 mM DSSతో సరైన క్రాస్‌లింకింగ్ గమనించబడింది మరియు IFNαతో చికిత్స చేయబడిన కణాల కోసం ఈ పరిస్థితులు ఎంపిక చేయబడ్డాయి.అదనంగా, ప్రోటీన్ క్రాస్-లింకింగ్ స్థాయిని అంచనా వేయడానికి p53 (DO-1) యాంటీబాడీని ఉపయోగించి చేసిన వెస్ట్రన్ బ్లాట్‌ను మూర్తి 1C చూపిస్తుంది.
క్రాస్‌లింకర్‌ను జోడించే ముందు ఫ్లో-1 కణాలు 24 గంటల పాటు 10 ng/ml IFNαతో చికిత్స చేయబడ్డాయి.క్రాస్-లింక్డ్ కణాలు రెండు-దశల ప్రోటీయోలిసిస్ ద్వారా లైస్ చేయబడ్డాయి మరియు ప్రోటీన్లు FASP ద్వారా ప్రాసెస్ చేయబడ్డాయి (Fig. 2)24,25.మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (Fig. 2) ద్వారా క్రాస్-లింక్డ్ ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లు విశ్లేషించబడ్డాయి.MS/MS స్పెక్ట్రా అప్పుడు ప్రోటీన్ సీక్వెన్స్‌తో సరిపోలుతుంది మరియు MaxQuant26,27తో లెక్కించబడుతుంది.SIM-XL ప్రోగ్రామ్‌ని ఉపయోగించి పొందిన స్పెక్ట్రా నుండి క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు xQuest28 మరియు SIM-XL29 ఓపెన్ సోర్స్ కంప్యూటింగ్ సాఫ్ట్‌వేర్ పైప్‌లైన్‌లను (Fig. 2) ఉపయోగించి వ్యక్తిగత సమ్మేళనాలు సంక్లిష్ట నెట్‌వర్క్‌గా మిళితం చేయబడ్డాయి.SIM-XL సాధారణ లేదా సంక్లిష్టమైన ప్రోటీన్ మిశ్రమాలలో ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు, అంతర్గత గొలుసులు మరియు వ్యక్తిగత గొలుసులను గుర్తిస్తుంది మరియు ప్రోటీన్ నిర్మాణాలలో పరస్పర చర్యలను దృశ్యమానం చేయడానికి స్క్రిప్ట్‌లను అందిస్తుంది.అదనంగా, ఇది MS/MS29 స్పెక్ట్రమ్ నాణ్యత ప్రకారం ప్రతి క్రాస్-రిఫరెన్స్‌ను ID స్కోర్‌గా ర్యాంక్ చేస్తుంది.అనేక అత్యంత విశ్వసనీయమైన ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు మరియు కాంప్లెక్స్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ (MD) మోడలింగ్ (Fig. 2) 30, 31 ఉపయోగించి కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ మరియు కన్ఫర్మేషనల్ మార్పులను ఉపయోగించి కొత్త పరస్పర చర్యలను మరింత పరిశోధించారు.
CLMS పద్ధతి యొక్క స్కీమాటిక్ అవలోకనం.ఫ్లో-1 కణాలు 24 గంటల పాటు 10 ng/ml IFNαతో చికిత్స చేయబడ్డాయి, తరువాత సెల్ లిసిస్ మరియు ట్రిప్సినైజేషన్ తర్వాత DSSని ఉపయోగించి సిటు ప్రోటీన్ క్రాస్-లింకింగ్‌లో ఉన్నాయి.ఆర్బిట్రాప్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌ని ఉపయోగించి క్రాస్-లింక్డ్ శాంపిల్స్ విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు LC-MS/MS సమయంలో పెప్టైడ్ పూర్వగాముల ఫ్రాగ్మెంటేషన్ కోసం మరింత నమూనా చేయబడ్డాయి.క్రాస్‌లింక్డ్ పెప్టైడ్స్ (SIM-XL) ప్రోగ్రామ్ యొక్క స్పెక్ట్రమ్ రికగ్నిషన్ మెషీన్‌ను ఉపయోగించి పొందిన స్పెక్ట్రా నుండి రెండు లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు గుర్తించబడ్డాయి మరియు అన్ని సమ్మేళనాలు గణన పైప్‌లైన్‌లను ఉపయోగించి సంక్లిష్ట నెట్‌వర్క్‌గా మిళితం చేయబడ్డాయి.తప్పుడు సానుకూల రేటు (FDR) స్కోర్‌ల ఆధారంగా తక్కువ విశ్వాస పరస్పర చర్యలను ఫిల్టర్ చేయండి.కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ ఉపయోగించి అనేక కొత్త హై-ఫిడిలిటీ ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్‌లు మరింత ధృవీకరించబడ్డాయి మరియు మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ (MD) మోడలింగ్ ఉపయోగించి కాంప్లెక్స్‌లలో కన్ఫర్మేషనల్ మార్పులు పరిశీలించబడ్డాయి.
మొత్తం ~ 30,500 మరియు ~ 28,500 పెప్టైడ్‌లు మాక్స్‌క్వాంట్‌ను ఉపయోగించి వరుసగా అన్‌స్టిమ్యులేటెడ్ మరియు స్టిమ్యులేటెడ్ IFNα శాంపిల్స్‌లో కనుగొనబడ్డాయి (సప్లిమెంటరీ టేబుల్ S1, ఫిగ్. 3A).రెండు సందర్భాల్లోనూ పెప్టైడ్ పొడవు పంపిణీ పెద్ద పెప్టైడ్‌ల యొక్క అధిక నిష్పత్తిని చూపించింది, ఇది క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌ల ఉనికిని సూచిస్తుంది (Fig. 3B,C).అదనంగా, IFNα-చికిత్స చేసిన నమూనాలలో (Fig. 3C) 40-55 పరిధిలో పెద్ద పెప్టైడ్‌ల యొక్క పెద్ద భాగం ఉంది.MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 మరియు HLA-F (Figure 3D)తో సహా చికిత్స చేయని నమూనాలతో పోలిస్తే క్లాసిక్ ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపిత ప్రోటీన్‌లు అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్నాయని log2 తీవ్రతకు వ్యతిరేకంగా ప్రోటీన్ మ్యాపింగ్ చూపించింది.రియాక్టోమ్ పాత్‌వే డేటాబేస్ ఉపయోగించి IFNα చికిత్సకు ప్రతిస్పందనగా ప్రోటీన్‌ల కోసం మూడు రెట్లు ఎక్కువ సుసంపన్నమైన మార్గాల విశ్లేషణ MHC-I-మధ్యవర్తిత్వ యాంటిజెన్ ప్రెజెంటేషన్ మరియు ప్రాసెసింగ్ అత్యంత ప్రబలమైన మార్గం అని చూపించింది (మూర్తి 3E).మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా, OAS మరియు ISG15 మధ్యవర్తిత్వం వహించిన యాంటీవైరల్ ప్రతిస్పందనలు అలాగే IFNα/β మరియు సైటోకిన్ సిగ్నలింగ్ సక్రియం చేయబడిన మార్గాలలో ఉన్నాయి.అదనంగా, SIM-XLని ఉపయోగించి వాస్తవానికి పొందిన MS/MS స్పెక్ట్రా నుండి లైసిన్- మరియు సెరైన్-నిర్దిష్ట ప్రోటీన్ క్రాస్-లింక్‌లు గుర్తించబడ్డాయి.5 సెల్ రకాల్లో వ్యక్తిగత ISG ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ అధ్యయనాల మెటా-విశ్లేషణ ద్వారా 9 వైరస్ తరగతుల నుండి 104 ISGలు 20 వైరస్‌లను విస్తరించాయని ఇటీవలి అధ్యయనం నివేదించింది.అయినప్పటికీ, పెద్ద డేటాసెట్‌లను స్క్రీనింగ్ చేయడంలో గణన పరిమితులను అధిగమించడానికి, పడారియా మరియు ఇతరులు నివేదించిన IRDS జన్యువుల జాబితా మధ్య సాధ్యమయ్యే పరస్పర చర్యలను అన్వేషించడానికి మేము చిన్న డేటాసెట్‌తో ప్రారంభించాము., వీటిలో ఎక్కువ భాగం ISGలు.
IFNαకి ప్రతిస్పందనగా విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన క్రాస్-లింక్డ్ ప్రోటీన్‌ల గుర్తింపు (MaxQuant నుండి పొందిన డేటా).(A) IFNα14 చికిత్స చేయబడిన మరియు చికిత్స చేయని Flo-1 నమూనాలలో గుర్తించబడిన సాధారణ మరియు ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల సంఖ్యను సూచించే వెన్ రేఖాచిత్రం.చికిత్స చేయని (B) మరియు IFNα చికిత్స చేయబడిన (C) క్రాస్‌లింక్డ్ నమూనాల పెప్టైడ్ పొడవు పంపిణీ.(D) చికిత్స చేయని మరియు IFNα14 చికిత్స చేయబడిన Flo-1 కణాల మధ్య log2 (LFQ తీవ్రత)ని సూచించే హీట్ మ్యాప్.ఎడమ పానెల్ IFNα సమక్షంలో అత్యంత చురుకుగా సక్రియం చేయబడిన ప్రోటీన్‌లను చూపుతుంది.(E) IFNα చికిత్స తర్వాత 20 ప్రధాన సుసంపన్నత మార్గాలను సూచించే హిస్టోగ్రాం.రియాక్టోమ్ పాత్వే డేటాబేస్ అధికంగా నియంత్రించబడిన IFNα- ప్రతిస్పందించే ప్రోటీన్‌లలో నాలుగు రెట్లు ఎక్కువ మార్పులను విశ్లేషించింది.
ఇంటర్ఫెరాన్-మధ్యవర్తిత్వ ISG స్టిమ్యులేషన్ చక్కగా నమోదు చేయబడింది, అయితే పరమాణు స్థాయిలో ఈ ప్రోటీన్‌లు విస్తృత శ్రేణి జీవసంబంధమైన విధుల్లో ఎలా ముగుస్తాయో సరిగా అర్థం కాలేదు.మేము తెలిసిన ISGల మధ్య అధిక విశ్వాసంతో ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను పరిశోధించాము.ఆసక్తికరంగా, మేము MX1, USP18, ROBO1, OAS3 మరియు STAT1 ప్రోటీన్‌లతో సహా నెట్‌వర్క్‌ను గుర్తించాము, ఇవి IFNα చికిత్సకు ప్రతిస్పందనగా పెద్ద కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరుస్తాయి (మూర్తి 4, టేబుల్ S2) 32,33,34.మరీ ముఖ్యంగా, ఈ పరస్పర చర్యలు IFNαతో చికిత్స చేయబడిన అన్ని త్రిపాదిలలో కనుగొనబడ్డాయి మరియు చికిత్స చేయని నమూనాలలో కనుగొనబడలేదు, ఇవి IFNα చికిత్సకు ప్రతిస్పందనగా ప్రత్యేకంగా ఏర్పడ్డాయని సూచిస్తున్నాయి.STAT1 ఈ ISGల వ్యక్తీకరణను లిప్యంతరీకరణగా నియంత్రిస్తుందని తెలుసు, అయితే ప్రోటీన్ స్థాయిలో ISGలతో దాని పరస్పర చర్య అధ్యయనం చేయబడలేదు.STAT1 యొక్క క్రిస్టల్ నిర్మాణం దాని హెలికల్ డొమైన్ (CCD) డైమర్స్ ఏర్పడే సమయంలో DNA లేదా ప్రోటోమర్‌లతో పరస్పర చర్యలో పాల్గొనలేదని చూపించింది.ఈ α-హెలిక్స్ ఒక హెలికల్ హెలిక్స్ నిర్మాణాన్ని ఏర్పరుస్తాయి, ఇది పరస్పర చర్యల కోసం ప్రధానంగా హైడ్రోఫిలిక్ ఉపరితల వైశాల్యాన్ని అందిస్తుంది 35 .మా CLMS డేటాలో, STAT1తో చాలా పరస్పర చర్యలు CCD, లింకర్ డొమైన్ లేదా C-టెర్మినల్ టెయిల్ (అవశేషాలు 700-708) (మూర్తి 4A) కంటే ముందు ఉన్న SH2 డొమైన్‌లో సంభవించాయని మేము గమనించాము.మునుపటి అధ్యయనం USP18 STAT2 యొక్క CCD మరియు DNA-బైండింగ్ డొమైన్ (DBD)తో బంధిస్తుంది మరియు టైప్ I ఇంటర్ఫెరాన్ సిగ్నలింగ్ 24 యొక్క నిరోధానికి మధ్యవర్తిత్వం వహించడానికి టైప్ I ఇంటర్‌ఫెరాన్ రిసెప్టర్ IFNAR2 యొక్క సబ్‌యూనిట్‌కు నియమించబడుతుందని నివేదించింది.USP18 ఉత్ప్రేరక డొమైన్ STAT1 DBD (Figure 4A,D)తో సంకర్షణ చెందుతుందని కూడా మా డేటా చూపించింది, USP18ని IFNAR2కి ఆకర్షించడంలో STAT1 మరియు STAT2 రెండూ పాత్ర పోషిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి.
IFNαతో చికిత్స చేయబడిన క్రాస్-లింక్డ్ సెల్‌లలో ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ ISG నెట్‌వర్క్ గుర్తించబడింది.(A) 2D ఇంటరాక్షన్ ప్లాట్ ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్‌లను చూపుతుంది (SIM-XL ప్రోగ్రామ్‌లో రూపొందించబడింది), ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ ఇంటరాక్షన్‌లను సూచించే పంక్తులు (క్రాస్‌లింక్ కటాఫ్ 3.5కి సెట్ చేయబడింది).విభిన్న గుర్తింపుల డొమైన్‌లు వాటి రంగు32 ద్వారా గుర్తించబడతాయి: MX1 డొమైన్, డైనమిన్_N (73–249), డైనమిన్_M (259–547), మరియు GED (569–660).OAS3 డొమైన్‌లు: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), మరియు OAS1_C (903-108).డొమైన్ ROBO1, Ig_3 (67–151), I-సెట్ (170–258), I-సెట్ (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) మరియు fn3 (777–864).STAT1 ఫీల్డ్‌లు: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), మరియు STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) పరస్పర చర్యలు మరియు పరస్పర చర్యలతో వరుసగా నీలం మరియు ఎరుపు రంగులలో లేబుల్ చేయబడిన క్రాస్-లింక్డ్ ప్రోటీన్‌ల (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 మరియు STAT1) వృత్తాకార వీక్షకుడు.క్రాస్-లింక్ థ్రెషోల్డ్ 3.5 వద్ద సెట్ చేయబడింది.డాట్ ప్లాట్లు MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), మరియు OAS3 (F)తో STAT1 ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లను సూచిస్తాయి, అలాగే రెండు పెప్టైడ్‌ల మధ్య K లేదా S ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లను సూచిస్తాయి.చిత్రంలో, క్రాస్-లింక్ స్కోర్ థ్రెషోల్డ్ 3.0కి సెట్ చేయబడింది.(G) STAT1 మరియు OAS3 DI డొమైన్‌ల మధ్య వివిధ ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లు PyMol (PyMOL మాలిక్యులర్ గ్రాఫిక్స్ సిస్టమ్, వెర్షన్ 2.0 ష్రోడింగర్, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) మరియు OAS3 (pdb id: 4s3n34).) కార్యక్రమం.
USP18 యొక్క రెండు ఐసోఫాంలు మానవులలో వర్ణించబడ్డాయి, ఇది ప్రధానంగా కేంద్రకంలో ఉన్న పూర్తి-నిడివి గల ప్రోటీన్ మరియు N-టెర్మినల్ డొమైన్ లేని USP18-sf, ఇది సైటోప్లాజం మరియు న్యూక్లియస్ 36లో సమానంగా పంపిణీ చేయబడుతుంది.అదనంగా, N-టెర్మినస్ నిర్మాణాత్మకంగా లేదని అంచనా వేయబడింది మరియు ఐసోపెప్టిడేస్ కార్యాచరణ లేదా ISG1537 బైండింగ్ అవసరం లేదు.మా అధ్యయనంలో గుర్తించబడిన చాలా పరస్పర చర్యలు ప్రోటీన్ యొక్క N- టెర్మినస్ వద్ద ఉన్నాయి, ఈ పరస్పర చర్యలలో పూర్తి-నిడివి USP18 (Figure 4A,D) ఉంటుంది మరియు తద్వారా కేంద్రకంలో సంభవించవచ్చు.అంతేకాకుండా, ప్రోటీన్-టు-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యల కోసం N- టెర్మినస్ ప్రత్యేకించబడిందని కూడా మా డేటా సూచిస్తుంది.IFNAR2 బైండింగ్ సైట్ అవశేషాలు 312-368 మధ్య ఉంది మరియు ముఖ్యంగా, కాంప్లెక్స్‌లోని ప్రోటీన్‌లు ఏవీ ఈ ప్రాంతానికి బంధించవు (Fig. 4A) 37,38 .కలిసి తీసుకున్న ఈ డేటా IFNAR2 బైండింగ్ డొమైన్ ప్రత్యేకంగా గ్రాహక ప్రోటీన్ ద్వారా ఉపయోగించబడుతుందని సూచిస్తుంది.అదనంగా, కేవలం OAS3 మరియు ROBO1 మాత్రమే N- టెర్మినస్ మరియు IFNAR2 బైండింగ్ సైట్ (Figure 4A) యొక్క అప్‌స్ట్రీమ్ డొమైన్‌లతో సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది.
ROBO1 ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ సిగ్నలింగ్ అణువుల యొక్క ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ (Ig) సూపర్ ఫామిలీకి చెందినది మరియు ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ప్రాంతంలో ఐదు Ig డొమైన్‌లు మరియు మూడు ఫైబ్రోనెక్టిన్ (Fn) డొమైన్‌లను కలిగి ఉంటుంది.ఈ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ డొమైన్‌లను మెమ్బ్రేన్-ప్రాక్సిమల్ రీజియన్ మరియు సింగిల్ ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ హెలిక్స్ 39 అనుసరిస్తాయి. నిర్మాణాత్మకమైన కణాంతర ప్రాంతం C-టెర్మినస్ వద్ద ఉంది మరియు ఎఫెక్టార్ ప్రోటీన్ బైండింగ్ మధ్యవర్తిత్వం వహించే సంరక్షించబడిన సీక్వెన్స్ మోటిఫ్‌లను కలిగి ఉంటుంది.అమైనో ఆమ్లాల నుండి ~1100 నుండి 1600 వరకు విస్తరించి ఉన్న ప్రాంతం ఎక్కువగా అస్తవ్యస్తంగా ఉంటుంది.MX1 Ig, Fn మరియు కణాంతర డొమైన్‌ల ద్వారా ROBO1తో సంకర్షణ చెందుతుందని మేము కనుగొన్నాము, అయితే STAT1తో చాలా పరస్పర చర్యలు దాని CCD, లింకర్ డొమైన్ మరియు ROBO1 యొక్క C-టెర్మినస్ (Fig. 4A,E) మధ్య జరుగుతాయి.మరోవైపు, DI, DIII మరియు OAS3 లింకర్ ప్రాంతాలతో పరస్పర చర్యలు ROBO1 ప్రోటీన్ (Fig. 4A) అంతటా పంపిణీ చేయబడ్డాయి.
ఒలిగోడెనిలేట్ సింథేస్ (OAS) ప్రోటీన్ కుటుంబం కణాంతర డబుల్ స్ట్రాండెడ్ RNA (dsRNA)ని అంగీకరిస్తుంది మరియు బంధిస్తుంది, ఆకృతీకరణ మార్పులకు లోనవుతుంది మరియు 2′,5′-లింక్డ్ ఒలిగోడెనిలేట్‌లను (2-5 As) 40 సంశ్లేషణ చేస్తుంది.మూడు OASలలో, OAS3 dsRNA పట్ల అత్యధిక అనుబంధాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది మరియు RNase Lని సక్రియం చేయగలదు మరియు తద్వారా వైరల్ రెప్లికేషన్ 41ని పరిమితం చేయగల 2-5 As యొక్క అతి తక్కువ మొత్తాన్ని సంశ్లేషణ చేస్తుంది.OAS కుటుంబం పాలిమరేస్ బీటా (పోల్-β)-వంటి న్యూక్లియోటైడ్ ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ డొమైన్‌లను కలిగి ఉంటుంది.C-టెర్మినల్ డొమైన్ (DIII) యొక్క ఉత్ప్రేరక చర్య OAS342 యొక్క క్రియాశీలతకు అవసరమైన dsRNA-బైండింగ్ డొమైన్ (DI)పై ఆధారపడి ఉంటుందని మునుపటి పరిశోధనలో తేలింది.OAS3 యొక్క DI మరియు DII డొమైన్‌లు CCD మరియు SH2 మరియు STAT1 TAD (Figure 4A,F) మధ్య ఒక చిన్న జంక్షన్ ప్రాంతంతో సంకర్షణ చెందుతాయని మేము గమనించాము.ప్రోటీన్ నిర్మాణంపై విభిన్న క్రాస్‌లింకింగ్ సైట్‌లను అతివ్యాప్తి చేయడం వలన β-షీట్ మరియు DBD STAT1 లూప్ మరియు OAS3 (Fig. 4G) యొక్క DI డొమైన్‌లో 60-75 అవశేషాల ద్వారా ఏర్పడిన ఓపెన్ పాకెట్ లేదా కుహరం మధ్య పరస్పర చర్య వెల్లడైంది.కాంప్లెక్స్‌లోని ప్రోటీన్‌ల విన్యాసాన్ని కూడా OAS3తో సంకర్షణలు ఏవీ దాని DI డొమైన్ (Fig. S1A) యొక్క DNA-బైండింగ్ సామర్థ్యంతో జోక్యం చేసుకోలేదని సూచించింది.అదనంగా, GTPase MX1 యొక్క N-టెర్మినల్ డొమైన్ OAS3 (Fig. 4A) యొక్క DI మరియు DIII డొమైన్‌లతో విస్తృతంగా సంకర్షణ చెందుతుంది.మూడు IFNα- చికిత్స చేసిన రిపీట్‌లలో OAS1 మరియు MX1 మధ్య పరస్పర చర్యను కూడా మేము గమనించాము, ఇక్కడ ఒకే OAS1 డొమైన్ (ఉత్ప్రేరకంగా కూడా సక్రియం) మూడు MX1 డొమైన్‌లతో సంకర్షణ చెందుతుంది (మూర్తి S2A,B).
MX ప్రొటీన్లు డైనేన్ లాంటి GTPases యొక్క పెద్ద కుటుంబంలో భాగం, ఇవి GTPని బంధించే మరియు హైడ్రోలైజ్ చేసే N-టెర్మినల్ GTPase డొమైన్‌ను కలిగి ఉంటాయి, స్వీయ-అసెంబ్లీకి మధ్యవర్తిత్వం వహించే ఇంటర్మీడియట్ డొమైన్ మరియు GTPase (LZ) వలె పనిచేసే C-టెర్మినల్ లూసిన్ జిప్పర్. )డొమైన్ ఎఫెక్టార్ డొమైన్25,43.MX1 వైరల్ జన్యువు యొక్క లిప్యంతరీకరణను నిరోధించడానికి వైరల్ పాలిమరేసెస్ యొక్క ఉపవిభాగాలతో బంధిస్తుంది43.గతంలో నివేదించబడిన ఈస్ట్ టూ-హైబ్రిడ్ స్క్రీన్ PIAS1-అనుబంధ MX1 DNA-బైండింగ్ కార్యాచరణను నిరోధించడం ద్వారా STAT1-మధ్యవర్తిత్వ జన్యు క్రియాశీలతను నిరోధిస్తుంది మరియు SUMO E344,45 లిగేస్ కార్యాచరణను కూడా కలిగి ఉంది.ఇక్కడ, MX1 STAT1 (Figure 4C,D)తో బంధిస్తుందని మేము నిరూపిస్తున్నాము, అయితే ఈ పరస్పర చర్య IFNαకి ప్రతిస్పందనగా STAT1-మధ్యవర్తిత్వ జన్యు క్రియాశీలతను ఎలా ప్రభావితం చేస్తుందో తదుపరి అధ్యయనం అవసరం.అదనంగా, MX1 IFIT3 మరియు DDX60తో మూడు IFNα-చికిత్స చేసిన రిపీట్‌లలో (Fig. S2C) సంకర్షణ చెందిందని కూడా మేము కనుగొన్నాము.
DDX60 అనేది IFN-ప్రేరిత సైటోప్లాస్మిక్ హెలికేస్, ఇది వైరల్ RNA46 యొక్క RIG-I-ఇండిపెండెంట్ డిగ్రేడేషన్‌లో పాత్ర పోషిస్తుందని గతంలో నివేదించబడింది.ఇది RIG-Iతో సంకర్షణ చెందుతుంది మరియు లిగాండ్-నిర్దిష్ట పద్ధతిలో దాని సిగ్నలింగ్‌ని సక్రియం చేస్తుంది 46. DDX60లో DEXD/H-బాక్స్ హెలికేస్ డొమైన్ మరియు వైరల్ RNA మరియు DNA47లను బంధించే C-టెర్మినల్ హెలికేస్ డొమైన్ ఉంటాయి.MX1 మరియు IFIT3తో దాని పరస్పర చర్యలలో ఎక్కువ భాగం కానానికల్ డొమైన్‌లు లేదా మూలాంశాలు (Fig. S2E,F) లేకుండా పొడవైన N- మరియు C-టెర్మినల్ ప్రాంతాలలో జరుగుతాయి.అయినప్పటికీ, MX1 కూడా DEXD/H-బాక్స్ హెలికేస్ డొమైన్‌తో అనుబంధించబడింది (Fig. S2E).IFIT కుటుంబానికి చెందిన ప్రోటీన్లు టెట్రాపెప్టైడ్ రిపీట్ (TPR) అని పిలువబడే విలక్షణమైన హెలిక్స్-టర్న్-హెలిక్స్ మూలాంశం యొక్క టెన్డం కాపీలను కలిగి ఉంటాయి.IFIT3 RIG-I సిగ్నలింగ్ యొక్క సానుకూల మాడ్యులేటర్‌గా గుర్తించబడింది మరియు అందువల్ల MAVS కాంప్లెక్స్‌లో ఒక భాగం.కలిసి చూస్తే, IFIT3 మరియు DDX60 ప్రధానంగా IFIT3 యొక్క TPR 3–6 మధ్య ప్రాంతంలో పరస్పర చర్య చేస్తాయని మరియు RIG-I/MAVS సిగ్నలింగ్‌లో (Fig. S2F) పాత్ర పోషిస్తుందని మా డేటా సూచిస్తుంది.
మొత్తం ప్రోటీమ్‌ను స్క్రీనింగ్ చేయడం గణనపరంగా ఇంటెన్సివ్ అయినందున, మేము IFNα- చికిత్స చేసిన రిపీట్‌లలో ఒకదాని ఉనికి కోసం మొత్తం మానవ UniProt డేటాబేస్‌ను పరీక్షించాము.ఈ ప్రతిరూపంలో, మేము HLA-A కోసం అనేక అత్యంత విశ్వసనీయమైన ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్‌లను కనుగొన్నాము.MS/MS స్పెక్ట్రా ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రోటీన్ మార్గాల విశ్లేషణ MHC-I-ఆధారిత యాంటిజెన్ ప్రాసెసింగ్ మరియు ప్రెజెంటేషన్ ఇంటర్‌ఫెరాన్ (Fig. 3D) ద్వారా ప్రేరేపించబడిన ప్రధాన మార్గం అని చూపించింది.అందువల్ల, మేము అన్ని క్రాస్-లింక్డ్ శాంపిల్స్‌పై అధిక విశ్వాసంతో MHC-I అణువుల ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను అధ్యయనం చేయడంపై దృష్టి సారించాము.HLA α1, α2 మరియు α3 డొమైన్‌లు మరియు లైట్ చైన్‌లను కలిగి ఉంటుంది మరియు మైక్రోగ్లోబులిన్ β2 (β2m) స్థిరమైన చాపెరోన్ ప్రోటీన్49.ఎండోప్లాస్మిక్ రెటిక్యులమ్‌లో ఒకసారి సమావేశమైన తర్వాత, పెప్టైడ్ లిగాండ్‌లు లేనప్పుడు HLA అస్థిరంగా ఉంటుంది.పెప్టైడ్-బైండింగ్ గ్రూవ్ నాన్-పెప్టైడ్ రూపంలో మరియు సాపేక్షంగా తక్కువ పాలీమార్ఫిక్ α351 డొమైన్‌లో అత్యంత పాలిమార్ఫిక్ మరియు నిర్మాణాత్మకంగా లేని α1 మరియు α2 డొమైన్‌ల ద్వారా ఏర్పడుతుంది.IFNα సమక్షంలో, మేము రెండు HLA-A కాంప్లెక్స్‌లను గుర్తించాము: ఒకటి HMGA1 మరియు H2B (మూర్తి 5, టేబుల్ S3) లతో సంకర్షణ చెందుతుంది మరియు మరొకటి MDN1, LRCH4 మరియు H2B (మూర్తి 6) లతో సంకర్షణ చెందుతుంది.
IFNα H2B (H2BFS) మరియు HMGA1తో HLA-A ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌లో వివిధ రకాల పరస్పర చర్యలను వర్ణించే 2D ప్లాట్ (SIM-XL సాఫ్ట్‌వేర్‌లో రూపొందించబడింది): ఇంటర్‌లింక్ (నీలం), ఇంటర్‌లింక్ (ఎరుపు) మరియు సింగిల్ లింక్ (నలుపు)..విభిన్న గుర్తింపుల డొమైన్‌లు కలర్ కోడ్32: H2B (హిస్టోన్; 2–102) మరియు MHC-I (MHC_1; 25–203, గ్రూప్ C1; 210–290 మరియు MHC_I_C; 337–364).క్రాస్-లింక్ థ్రెషోల్డ్ 3.5 వద్ద సెట్ చేయబడింది.డాట్ ప్లాట్లు H2B (B) మరియు HMGA1 (C)తో HLA-A ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లను సూచిస్తాయి, అలాగే రెండు పెప్టైడ్‌ల మధ్య K లేదా S ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లను సూచిస్తాయి.చిత్రంలో, క్రాస్-లింక్ స్కోర్ థ్రెషోల్డ్ 3.0కి సెట్ చేయబడింది.(D) PyMOL ప్రోగ్రామ్‌లోని H2B, HLA-A మరియు HMGA1 ప్రోటీన్‌ల నిర్మాణాలలో చూపబడిన ప్రోటీన్‌ల మధ్య సంబంధాలు.ఈ నిర్మాణాలు Phyre2 సర్వర్ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)ని ఉపయోగించి రూపొందించబడ్డాయి మరియు H2B, HLA-A మరియు HMGA1 ప్రోటీన్‌ల కోసం టెంప్లేట్ నిర్మాణాలు వరుసగా 1kx552, 1kj349 మరియు 2eze55.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 మరియు LRCH4తో HLA-A ఇంటరాక్షన్ నెట్‌వర్క్‌ను ప్రేరేపిస్తుంది.(A) 2D ఇంటరాక్టివ్ మ్యాప్‌లో (SIM-XL సాఫ్ట్‌వేర్‌లో రూపొందించబడింది) ప్రదర్శించబడిన ఇంట్రామోలెక్యులర్ (ఎరుపు) మరియు ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ (నీలం) క్రాస్‌లింక్‌లు MDN1 సర్కిల్‌గా సూచించబడతాయి.క్రాస్-లింక్ థ్రెషోల్డ్ 3.5 వద్ద సెట్ చేయబడింది.విభిన్న గుర్తింపుల డొమైన్‌లు రంగు కోడెడ్32: H2B (హిస్టోన్; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, గ్రూప్ C1; 210–290 మరియు MHC_I_C; 337–364) మరియు LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) మరియు CH (535–641)).(B) PyMOL ప్రోగ్రామ్‌లోని H2B, HLA-A, LRCH4 మరియు MDN1 ప్రొటీన్‌ల నిర్మాణాలలో చూపబడిన ప్రోటీన్‌ల మధ్య సంబంధాలు.H2B, HLA-A, LRCH4 మరియు MDN1 ప్రోటీన్‌ల కోసం 1kx552, 1kj349, 6hlu62 మరియు 6i2665 టెంప్లేట్ నిర్మాణాలతో Phyre2 సర్వర్ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ఉపయోగించి ఈ నిర్మాణాలు రూపొందించబడ్డాయి, వరుసగా.H2B (C), LRCH4 (D), మరియు MDN1 (E)తో HLA-A కోసం K లేదా S ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లను చూపించే డాట్ ప్లాట్లు.ప్లాట్‌ల కోసం, క్రాస్-లింక్ స్కోర్ థ్రెషోల్డ్ 3.0కి సెట్ చేయబడింది.
జన్యువు యొక్క సమగ్రతను కాపాడుకోవడంతో పాటు, ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ నియంత్రణలో హిస్టోన్ H2B కూడా పాల్గొంటుంది.H2B ప్రొటీన్ సెంట్రల్ హిస్టోన్ డొమైన్ (HFD)ని కలిగి ఉంటుంది, ఇది మూడు α-హెలిక్‌లు లూప్‌ల ద్వారా వేరు చేయబడుతుంది మరియు C-టెర్మినల్ టెయిల్ 41,52.H2Bతో చాలా పరస్పర చర్య α1 హెలిక్స్‌లో జరుగుతుంది, ఇది HFD హెటెరోడైమర్ (Fig. 5A,B)తో ట్రిమెరైజేషన్‌ను అందిస్తుంది.DNA బైండింగ్‌లో లైసిన్‌లు పాల్గొన్నప్పటికీ, కొన్ని లైసిన్‌లు ప్రత్యామ్నాయ ఎసిటైలేషన్ లేదా మిథైలేషన్ సైట్‌లు కూడా.ఉదాహరణకు, H2B నుండి K43, K46 మరియు K57 అవశేషాలు ప్రత్యక్ష DNA బైండింగ్‌లో పాల్గొనవు, అయితే ఇవి వివిధ పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ సవరణల లక్ష్యాలు53.అదేవిధంగా, H2Bలోని K44, K47 మరియు K57 అవశేషాలు IFNα సమక్షంలో ఇతర ప్రోటీన్‌లతో పరస్పర చర్యలతో సహా ప్రత్యామ్నాయ పాత్రను పోషిస్తాయి (Fig. 5A, B).అదనంగా, ఎక్స్‌ట్రాక్రోమోజోమల్ హిస్టోన్ H2B వివిధ కణ రకాల్లో రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను సక్రియం చేస్తుంది, ఇన్ఫెక్షియస్ ఏజెంట్లు లేదా దెబ్బతిన్న కణాల నుండి పొందిన డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA (dsDNA) శకలాలను గుర్తించడానికి సైటోసోలిక్ సెన్సార్‌గా పనిచేస్తుంది.DNA వైరస్‌ల సమక్షంలో, H2B క్షీణత IFN-β ఉత్పత్తిని మరియు STAT154 ఫాస్ఫోరైలేషన్‌ను నిరోధించింది.H2B ఇతర కోర్ హిస్టోన్‌ల కంటే వేగంగా న్యూక్లియస్ లోపలికి మరియు వెలుపలికి కదులుతుంది.ఎంచుకున్న చికిత్స చేయని నమూనాలలో MDN1 మరియు LRCH4తో H2B పరస్పర చర్యలు కూడా గమనించబడ్డాయి.HLA-A మూడు IFNα- చికిత్స చేసిన నమూనాలలో మరియు ఒక చికిత్స చేయని పునరావృత నమూనాలో H2Bతో సంకర్షణ చెందిందని మేము కనుగొన్నాము.ఈ డేటా ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ రెగ్యులేషన్ నుండి స్వతంత్రంగా ప్రత్యామ్నాయ ఫిజియోలాజికల్ ఫంక్షన్‌లో H2B పాత్రను ప్రతిబింబిస్తుంది.
HMGA1 (హై మొబిలిటీ గ్రూప్ AT-హుక్ 1), వ్యాధి-ప్రోత్సాహక అమైనో ఆమ్లాలతో కూడిన ఒక చిన్న న్యూక్లియోప్రొటీన్, HLA-Aతో కలిసి గుర్తించబడింది.ఇది ఒక ఆమ్ల C-టెర్మినల్ టెయిల్ మరియు AT హుక్స్ అని పిలువబడే మూడు విభిన్న DBDలను కలిగి ఉంటుంది, ఎందుకంటే అవి dsDNA55,56లో AT-రిచ్ ప్రాంతం యొక్క చిన్న గాడితో బంధిస్తాయి.ఈ బైండింగ్ DNA వంగడానికి లేదా నిఠారుగా చేయడానికి కారణమవుతుంది, కానానికల్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలు దాని ఏకాభిప్రాయ క్రమాన్ని యాక్సెస్ చేయడానికి అనుమతిస్తుంది.సి-టెర్మినల్ తోక ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలలో మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాల నియామకంలో పాల్గొంటుందని నమ్ముతారు, ఎందుకంటే సి-టెర్మినల్ తొలగింపు మార్పుచెందగలవారు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను ప్రారంభించలేరు.అంతేకాకుండా, ఈ డొమైన్ అనేక సంరక్షించబడిన ఫాస్ఫోరైలేషన్ సైట్‌లను కలిగి ఉంది, అవి కైనేసెస్ 58 కోసం తెలిసిన సబ్‌స్ట్రేట్‌లు.మేము C-టెర్మినల్ డొమైన్ వెలుపల HMGA1తో HLA-A మరియు H2B పరస్పర చర్యలను గమనించాము, C-టెర్మినల్ డొమైన్ ప్రధానంగా ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ బైండింగ్ కోసం ఉపయోగించబడుతుందని సూచిస్తున్నాము (Fig. 5A, C).HMGA ప్రొటీన్‌లు అడాప్టర్ DNAతో బంధించడానికి హిస్టోన్ H1తో పోటీపడతాయి, తద్వారా యాక్సెసిబిలిటీ పెరుగుతుంది.అదేవిధంగా, HMGA హిస్టోన్ H1కి పోటీగా లింకర్ DNAతో పాటు హిస్టోన్ H2Bతో సంకర్షణ చెందుతుంది.HMGB1 డెన్డ్రిటిక్ కణాలలో HLA-A, -B మరియు -C యొక్క వ్యక్తీకరణను ప్రేరేపిస్తుంది, ఇది వాటి క్రియాశీలతకు దారితీస్తుంది, అయితే HMG మరియు HLA మధ్య పరస్పర చర్య ఇంతకు ముందు నివేదించబడలేదు.HMGA1 HLA-A యొక్క α1 మరియు α3 డొమైన్‌లతో దాని 3 DBD (Figure 5A,C) వెలుపల చాలా పరస్పర చర్యలతో సంకర్షణ చెందుతుందని మేము కనుగొన్నాము.మన చేతుల్లో, HLA-A న్యూక్లియస్‌లో స్థానీకరించబడినట్లు కనుగొనబడింది (డేటా చూపబడలేదు), మరియు H2B మరియు HMGA1 కూడా కేంద్రకంలో ఉన్నందున, ఈ పరస్పర చర్య కేంద్రకంలో సంభవించవచ్చు.H2B, HLA-A మరియు HMGA1 మధ్య కొలవబడిన నిర్దిష్ట వ్యసనాలు మూర్తి 5Dలో చూపబడ్డాయి.
ఇతర ప్రొటీన్‌లతో HLA-A యొక్క చాలా పరస్పర చర్యలు దాని α1 మరియు α2 డొమైన్‌లు మరియు అస్తవ్యస్తమైన C-టెర్మినల్ డొమైన్‌లో జరుగుతాయి (Fig. 6).ఈ ఉదాహరణలలో ఒకదానిలో, LRCH4 (Figure 6A,D) యొక్క క్రమరహిత N-టెర్మినల్ టెయిల్‌తో HLA-A సంకర్షణ చెందుతుందని మేము కనుగొన్నాము.LRCH4 TLR4 యాక్టివేషన్ మరియు LPS సైటోకిన్ ఇండక్షన్‌ను నియంత్రిస్తుంది, తద్వారా సహజమైన రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనను మాడ్యులేట్ చేస్తుంది60,61.ఇది తొమ్మిది ల్యుసిన్-రిచ్ రిపీట్‌లు (LRRలు) మరియు దాని ఎక్టోడొమైన్‌లో ఒక కాల్మోడ్యులిన్ (CH) హోమోలజీ మోటిఫ్‌తో కూడిన మెమ్బ్రేన్ ప్రోటీన్, దీని తర్వాత ట్రాన్స్‌మెంబ్రేన్ డొమైన్ (TMD) 60 , 62 .CH డొమైన్‌లు ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలకు మధ్యవర్తిత్వం వహించడానికి నివేదించబడ్డాయి 60 .LRR మరియు CH డొమైన్‌ల మధ్య దాదాపు 300 అమైనో ఆమ్లాల విస్తరణ సాపేక్షంగా అందుబాటులో ఉంటుంది కానీ క్రమరహితంగా ఉంటుంది.ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లు మరియు వెసిక్యులర్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ 63 మధ్యవర్తులుగా క్రమరహిత ప్రాంతాల పనితీరు ఆధారంగా, చాలా ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు క్రమరహిత ప్రాంతాలలో జరుగుతాయని మేము కనుగొన్నాము.MDN1తో సంకర్షణలు LRR1, LRR6, CH డొమైన్‌లు మరియు యాదృచ్ఛిక ప్రాంతాలతో సహా ప్రోటీన్ పొడవు అంతటా పంపిణీ చేయబడ్డాయి, అయితే H2B ప్రధానంగా CH డొమైన్‌కు కట్టుబడి ఉంటుంది (Fig. 6A, B).ముఖ్యంగా, CLMS విధానం యొక్క విశిష్టతను సూచిస్తూ, పరస్పర చర్యలలో ఏదీ TMJని చేర్చలేదు (మూర్తి 6A, B).
MDN1 కూడా HLA-A ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌లో భాగంగా గుర్తించబడింది (మూర్తి 6A).ఇది AAA ప్రొటీన్ల కుటుంబానికి చెందినది (వివిధ కార్యకలాపాలతో అనుబంధించబడిన ATPaseలు).ఇదే N-టెర్మినల్ AAA డొమైన్, ఇది హెక్సామెరిక్ రింగ్‌గా నిర్వహించబడుతుంది మరియు 60S 64 రైబోసోమల్ సబ్యూనిట్ నుండి అసెంబ్లీ ఫ్యాక్టర్‌ను తొలగిస్తుంది.dynein64,65,66 లాగా కనిపిస్తుంది.అదనంగా, Asp/Glu రిచ్ రీజియన్‌ను MIDAS డొమైన్ (మెటల్ అయాన్ డిపెండెంట్ సైట్) అనుసరిస్తుంది.MDN1 యొక్క పెద్ద పరిమాణం (సుమారు 5600 అమైనో ఆమ్లాలు) మరియు బాగా అధ్యయనం చేయబడిన ప్రోటీన్లతో దాని పరిమిత హోమోలజీ కారణంగా, మానవులలో దాని నిర్మాణం మరియు పనితీరు గురించి చాలా తక్కువగా తెలుసు.మేము HLA-A, H2B మరియు LRCH4లను MDN1 బైండింగ్ భాగస్వాములుగా గుర్తించాము మరియు PyMol (Fig. 6A,B)లో ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లుగా వాటి విన్యాసాన్ని వెల్లడించాము.ఈ మూడు ప్రొటీన్లు AAA డొమైన్, డైనేన్ లాంటి లింకర్ డొమైన్ మరియు బహుశా MIDAS MDN1 డొమైన్‌తో సంకర్షణ చెందుతాయి.మునుపటి నివేదికలో, ఎర ప్రోటీన్ల యొక్క అనుబంధ శుద్దీకరణ MDN1 హిస్టోన్ H2B67తో అనుబంధించబడిన ప్రోటీన్‌గా గుర్తించబడింది.అదనంగా, ఇటీవలి అధ్యయనం HCT116 కణాలలో MDN మరియు HLA-B మధ్య పరస్పర చర్యను అనుబంధ-శుద్ధి చేసిన మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీని ఉపయోగించి నివేదించింది, ఇది మా పరిశోధనలకు మద్దతు ఇస్తుంది.IFNα- చికిత్స చేసిన నమూనాలలో ఈ కాంప్లెక్స్ యొక్క గుర్తింపు ఇంటర్ఫెరాన్ సిగ్నలింగ్‌లో MDN1 పాత్రను సూచిస్తుంది.
HLA జన్యువులు అత్యంత పాలీమార్ఫిక్ అయినందున, ఫ్లో-1 కణాల RNA సీక్వెన్సింగ్ డేటా నుండి HLA-A, -B మరియు -C మ్యాపింగ్ సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌లను మేము సంగ్రహించాము (డేటా చూపబడలేదు).సీక్వెన్సింగ్ రీడింగ్‌కు అనుగుణంగా ఉండే పెప్టైడ్ సీక్వెన్సులు HLA-A (Figure S3)లో క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు ఉన్న ప్రాంతాలలో HLA-A, -B మరియు -C మధ్య ముఖ్యమైన తేడాలను వెల్లడించాయి.అదనంగా, H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 ప్రోటీన్‌లతో HLA-B/C అణువుల ప్రోటీన్-టు-ప్రోటీన్ క్రాస్-లింకింగ్‌ను మేము గమనించలేదు.HLA-A, MDN1, LRCH1 మరియు HMGA1 మధ్య ప్రోటీన్ పరస్పర చర్య HLA-A నిర్దిష్టమైనదని ఇది సూచిస్తుంది.అదనంగా, నాన్-క్రాస్‌లింక్డ్ శాంపిల్స్ (టేబుల్ S4) యొక్క ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ HLA-B లేదా HLA-C తో పోలిస్తే HLA-A అధిక సీక్వెన్స్ కవరేజీని కలిగి ఉందని చూపించింది.HLA-A కోసం గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు IFNα-చికిత్స చేయబడిన మరియు చికిత్స చేయని నమూనాలు రెండింటిలోనూ అధిక తీవ్రతను కలిగి ఉన్నాయి.
ఇక్కడ గుర్తించబడిన సంకర్షణలు రెండు ప్రొటీన్‌ల యొక్క నిర్దిష్ట క్రాస్-లింకింగ్ కారణంగా జరగలేదని నిర్ధారించుకోవడానికి, మేము కో-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ అస్సేస్ చేయడం ద్వారా రెండు కొత్త HLA-A ఇంటరాక్టింగ్ కారకాలను మరింత ధృవీకరించాము.ఎండోజెనస్ MDN1 మరియు H2Bతో HLA-A పరస్పర చర్యలు IFNα-చికిత్స చేయబడిన మరియు చికిత్స చేయని Flo-1 కణాలలో కనుగొనబడ్డాయి (మూర్తి 7, మూర్తి S4).HLA-A ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్‌లలో H2B చేత సంగ్రహించబడిందని మరియు చికిత్స చేయని కణాల నుండి ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ నమూనాలలో HLA-A లేనందున IFNα చికిత్స కారణంగా ఈ అనుబంధం జరిగిందని మేము ధృవీకరించాము (మూర్తి 7A).అయినప్పటికీ, H2B మరియు MDN1కి HLA-A బైండింగ్‌ను IFNα భేదాత్మకంగా నియంత్రిస్తుందని మా డేటా సూచిస్తుంది.IFNα H2B మరియు HLA-A మధ్య అనుబంధాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది, కానీ MDN1తో దాని అనుబంధాన్ని తగ్గిస్తుంది.MDN1 నియంత్రణలలో HLA-Aతో అనుబంధించబడిందని మేము కనుగొన్నాము మరియు IFNα యొక్క జోడింపు IFNα (Figure 7B,C) ద్వారా MDN1 ఇండక్షన్ నుండి స్వతంత్రంగా ఈ పరస్పర చర్యను తగ్గించింది.అదనంగా, HLA-A ఇమ్యునోప్రెసిపిటేషన్ A549 కణాలలో H2Bని సంగ్రహించింది (Fig. S4), ఈ పరస్పర చర్య సెల్ రకం నుండి స్వతంత్రంగా ఉంటుందని సూచిస్తుంది.కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు H2B మరియు MDN1తో HLA-A యొక్క ఇంటర్‌ఫెరాన్-మధ్యవర్తిత్వ పరస్పర చర్యలకు మద్దతు ఇస్తాయి.
HLA-A H2B మరియు MDN1లను సహ-శుద్ధి చేస్తుంది.ప్రతినిధి ఎండోజెనస్ H2B (A) మరియు MDN1 (B) ఇమ్యునోబ్లోట్‌లు IFNα- చికిత్స చేసిన ఫ్లో-1 కణాల నుండి ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయబడ్డాయి మరియు సూచించిన ప్రతిరోధకాల కోసం పరిశీలించబడ్డాయి.మౌస్ మరియు కుందేలు IgG ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడ్డాయి.(సి) వివిధ యాంటిజెన్‌ల యొక్క సాపేక్ష మొత్తాలు (ఇన్‌పుట్) సూచించబడిన ప్రతిరోధకాలపై పరిశీలించబడిన ఇమ్యునోబ్లోట్‌ల ద్వారా వర్ణించబడతాయి, β-ఆక్టిన్ లోడింగ్ నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది.
ఇంటర్ఫెరాన్-ప్రేరిత అత్యంత విశ్వసనీయమైన క్రాస్-లింక్డ్ నెట్‌వర్క్‌లలో ఒకటైన H2B-HLA-A-HMGA1 యొక్క నిర్మాణ లక్షణాలు పరిశోధించబడ్డాయి.ఈ కాంప్లెక్స్‌లో పాల్గొన్న ప్రోటీన్‌ల కన్ఫర్మేషనల్ డైనమిక్‌లను అర్థం చేసుకోవడానికి మేము మాలిక్యులర్ డైనమిక్స్ మోడలింగ్‌ను ప్రత్యామ్నాయ విధానంగా ఉపయోగించాము (మూర్తి 8).CLMS డేటా నుండి వచ్చిన అనుమానాలు H2B, HLA-A మరియు HMGA1 ప్రొటీన్‌ల యొక్క విభిన్న ఆకృతీకరణల అవకాశాన్ని సూచిస్తున్నాయి.అందువల్ల, కింది సంభావ్య సముదాయాలు ద్రావణి మాధ్యమంలో రూపొందించబడ్డాయి: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A మరియు H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (మాలిక్యులర్ ఆపరేటింగ్ ఎన్విరాన్‌మెంట్; కెమికల్ కంప్యూటింగ్ గ్రూప్ ఇంక్., మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) ప్యాకేజీని ఉపయోగించి ప్రారంభ ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ డాకింగ్ స్క్రీన్ ఈ ప్రొటీన్‌ల మధ్య వ్యత్యాసం ఉండే అవకాశం ఉన్న ఆకృతీకరణలను సూచించింది (Fig. 8A).డాకింగ్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్ యొక్క విజువలైజేషన్ అనేక పరస్పర చర్యలు మరియు సాధ్యమయ్యే ఆకృతీకరణలను వెల్లడించింది (మూర్తి 5A, 8).అందువల్ల, ఒక సాధ్యమైన ఆకృతి మూర్తి 8A (లేబుల్ చేయబడిన క్రాస్-లింక్‌లతో)లో చూపబడింది మరియు ఇది MD మోడలింగ్ పైప్‌లైన్ ఉపయోగించి మరింత మూల్యాంకనం చేయబడింది.అదనంగా, H2B లేదా HMGA1ని HLA-Aకి బంధించడం HLA-Aకి H2B యొక్క అధిక అనుబంధాన్ని హైలైట్ చేస్తుంది (Fig. 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A మరియు H2B-HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌ల మధ్య సాధ్యమయ్యే నెట్‌వర్క్‌ల కన్ఫర్మేషనల్ డైనమిక్స్.(A) లెఫ్ట్ పానెల్ అనేది ఇంట్రామోలెక్యులర్ (ఎరుపు) మరియు ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ (బ్లూ) క్రాస్‌లింక్‌ల (క్రాస్‌లింక్ కటాఫ్ 3.5కి సెట్ చేయబడింది) యొక్క 2D మ్యాప్ (SIM-XL సాఫ్ట్‌వేర్‌లో రూపొందించబడింది).అదనంగా, గుర్తించబడిన క్రాస్-లింకింగ్ అవశేషాలు H2B, HLA-A మరియు HMGA1 ప్రోటీన్‌ల నిర్మాణాలపై లేబుల్ చేయబడ్డాయి.MOE ప్యాకేజీలో అమలు చేయబడిన డాకింగ్ పైప్‌లైన్‌ని ఉపయోగించి ఈ ప్రోటీన్‌ల అనుబంధ ఆకృతీకరణలు సంగ్రహించబడ్డాయి.దిగువ ఎడమ పానెల్ వివిధ ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ బైండింగ్ అనుబంధాలతో (GBVI/WSA dG; kcal/mol) H2B-HLA-A మరియు HMGA1-HLA-A కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క వివిధ సాధ్యమైన ఆకృతీకరణలను చూపుతుంది.(B) ప్రతి ప్రోటీన్ నిర్మాణం కోసం పరమాణు స్థానాల (హైడ్రోజన్ పరమాణువులు మినహా) ప్రామాణిక విచలనం (RMSD).(C) వ్యవధి ≥ 10 ns యొక్క నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యలను పరిగణనలోకి తీసుకుని వివిధ అనుకరణ కాంప్లెక్స్‌ల నుండి ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ హైడ్రోజన్ బాండ్ ఇంటరాక్షన్‌లు.h-బాండ్ డోనర్-యాక్సెప్టర్ కటాఫ్ దూరం 3.5 Åకి సెట్ చేయబడింది మరియు దాత-H-అంగీకార కటాఫ్ కోణం ≥ 160°–180°కి సెట్ చేయబడింది.(D) డమ్మీ HLA-A-H2B మరియు HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌ల నుండి సంగ్రహించబడిన ≥20 ns విస్తీర్ణంలో, HLA-A ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను రూపొందించే లేబుల్ అవశేషాలు.ప్రోటీన్ నిర్మాణాలు 100 ns MDS యొక్క సగటు నిర్మాణాన్ని సూచిస్తాయి.(E) రెండు పెప్టైడ్‌ల మధ్య K లేదా S ఇంటరాక్షన్ సైట్ ఆధారంగా 100 ns కంటే ఎక్కువ H2B-HLA అనుకరణ ద్వారా ట్రాక్ చేయబడిన పరస్పర చర్యలతో పోలిస్తే HLA-A-H2B మరియు HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌ల మధ్య పరస్పర చర్యలు.కాంప్లెక్స్‌లు /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.క్రాస్-లింక్‌ల మూల్యాంకనం కోసం థ్రెషోల్డ్ విలువ 3.0కి సెట్ చేయబడింది మరియు MDS నుండి ≥10 ns తీసుకునే నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యలు పరిగణనలోకి తీసుకోబడ్డాయి.BIOVIA డిస్కవరీ స్టూడియో (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) మరియు మాలిక్యులర్ ఆపరేటింగ్ ఎన్విరాన్‌మెంట్ (MOE; కెమికల్ కంప్యూటింగ్ గ్రూప్ ఇంక్., మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) ప్యాకేజీలను ఉపయోగించి ప్రోటీన్ నిర్మాణాలు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.
కాలక్రమేణా HLA-A అణువుల స్థిరత్వం (ప్రామాణిక విచలనం; RMSD లేదా ప్రామాణిక విచలనం; RMSF) కాంప్లెక్స్‌లలో H2B లేదా HMGA1 ప్రోటీన్‌ల ఉనికి HLA-Aని స్థిరీకరించిందని సూచించింది (మూర్తి 8B, మూర్తి S5).HMGA1 ప్రోటీన్ HLA-A యొక్క B2M సైట్‌తో గట్టిగా బంధిస్తుంది, HLA-A-HMGA1 లేదా H2B-HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌లో HLA-A అమైనో ఆమ్లాల స్థిరత్వాన్ని ప్రేరేపిస్తుంది (మూర్తి 8B, మూర్తి S5).ప్రత్యేకించి, HLA అవశేషాలు ~60-90 మరియు ~180-210 H2B (FIG. 8B) సమక్షంలో తక్కువ అనువైనవిగా గుర్తించబడ్డాయి.H2B మరియు HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌లో HLA-Aకి H2B లేదా HMGA1కి మాత్రమే బైండింగ్ చేయడంతో పోలిస్తే HLA-Aకి మెరుగైన బైండింగ్‌ను చూపించాయి (మూర్తి 8C,D; టేబుల్ S5).హైడ్రోజన్ బంధంలో ఉన్న అవశేషాలు (MD మోడల్డ్ హై ఆక్యుపెన్సీ ≥10 ns) కాంప్లెక్స్‌లోని CLMS ఇంటరాక్షన్ సైట్‌లతో (K లేదా S అవశేషాలు) సమానంగా ఉంటాయి, CLMS ద్వారా గుర్తించబడిన పరస్పర చర్యలు చాలా నమ్మదగినవి అని సూచిస్తున్నాయి.విశ్వసనీయత (Fig. 8E ).CLMS మరియు MD మోడలింగ్‌లో, దాదాపు 190-210 మరియు దాదాపు 200-220 అమైనో ఆమ్లాల మధ్య ఉన్న HLA-A అవశేషాలు వరుసగా H2B మరియు HMGA1లను బంధించడానికి కనుగొనబడ్డాయి (FIG. 8E).
ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలు డైనమిక్ స్ట్రక్చరల్ నెట్‌వర్క్‌లను ఏర్పరుస్తాయి, ఇవి కొన్ని ఉద్దీపనలకు ప్రతిస్పందనగా కణాంతర కమ్యూనికేషన్‌ను మధ్యవర్తిత్వం చేస్తాయి.అనేక ప్రోటీమిక్స్ విధానాలు ప్రోటీన్ యొక్క మొత్తం స్థిరమైన స్థితిలో మార్పులను గుర్తించడం వలన, ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్ డైనమిక్స్ బైండింగ్ ఇంటర్‌ఫేస్‌లను సంగ్రహించడానికి అదనపు సాధనాలు అవసరం మరియు CLMS అటువంటి సాధనం.ఇంటర్ఫెరాన్ సిగ్నలింగ్ సిస్టమ్ అనేది సైటోకిన్ నెట్‌వర్క్, ఇది కణాలను పర్యావరణ వ్యాధికారక మరియు అంతర్గత రోగలక్షణ సంకేతాల శ్రేణికి ప్రతిస్పందించడానికి అనుమతిస్తుంది, ఇది ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌ల ఉపసమితుల ప్రేరణతో ముగుస్తుంది.ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరిత ప్రోటీన్‌ల ప్యానెల్‌లో నవల ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను గుర్తించవచ్చో లేదో తెలుసుకోవడానికి మేము CLMSని వర్తింపజేసాము.ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లను సంగ్రహించడానికి ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రతిస్పందించే ఫ్లో-1 సెల్ మోడల్‌లో గ్లోబల్ ప్రోటీన్ క్రాస్-లింకింగ్ విశ్లేషణ ఉపయోగించబడింది.నాన్-క్రాస్-లింక్డ్ మరియు క్రాస్-లింక్డ్ సెల్స్ నుండి ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లను సంగ్రహించడం పెప్టైడ్ లెక్కింపు, పాత్‌వే ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ మరియు పెప్టైడ్ పొడవు పంపిణీని నిర్వచించిన LFQ తీవ్రతతో అనుమతిస్తుంది.కానానికల్ ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌లు సానుకూల అంతర్గత నియంత్రణగా గుర్తించబడ్డాయి, అయితే MX1, UP18, OAS3 మరియు STAT1 వంటి కానానికల్ ఇంటర్‌ఫెరాన్-ప్రేరేపించగల ప్రోటీన్‌ల యొక్క కొత్త ఇంటర్‌మోల్క్యులర్ మరియు ఇంట్రామోలెక్యులర్ క్రాస్-లింక్డ్ అడక్ట్‌లు గమనించబడ్డాయి.ఫంక్షనల్ ప్రాంతాలలో వివిధ నిర్మాణ లక్షణాలు మరియు పరస్పర చర్యలు పరిశోధించబడ్డాయి.
IFNαతో చికిత్స చేయబడిన మరియు చికిత్స చేయని ఫ్లో-1 మరియు A549 కణాలలో ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ ద్వారా HLA-A, MDN1 మరియు H2B మధ్య పరస్పర చర్య కనుగొనబడింది.IFNα-ఆధారిత పద్ధతిలో H2Bతో HLA-A కాంప్లెక్స్‌లు ఉన్నాయని మా ఫలితాలు హైలైట్ చేస్తాయి.ఈ రెండు కాంప్లెక్స్‌ల సహ-స్థానికీకరణను మరింత అన్వేషించడానికి మా పని ఒక ఆసక్తికరమైన మార్గాన్ని సూచిస్తుంది.సెల్-రకం-స్వతంత్ర ఇంటర్ఫెరాన్-మధ్యవర్తిత్వ ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలను గుర్తించడానికి సెల్ లైన్ల ప్యానెల్‌కు CLMS విధానాన్ని విస్తరించడం కూడా ఆసక్తికరంగా ఉంటుంది.చివరగా, H2BFS-HLA-A-HMGA1 కాంప్లెక్స్‌లో పాల్గొన్న ప్రోటీన్ల యొక్క కన్ఫర్మేషనల్ డైనమిక్స్‌ను అర్థం చేసుకోవడానికి మేము MD మోడలింగ్‌ను ప్రత్యామ్నాయ విధానంగా ఉపయోగించాము, ఇది ఇంట్రామోలిక్యులర్ మరియు ఇంటర్‌మోలిక్యులర్ క్రాస్-టాక్‌లను ట్రాక్ చేస్తుంది.CLMS డేటా నుండి వచ్చిన అనుమానాలు H2BFS, HLA-A మరియు HMGA1 ప్రొటీన్‌ల యొక్క విభిన్న ఆకృతీకరణల అవకాశాన్ని సూచిస్తున్నాయి.ఈ డాకింగ్ ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల మధ్య సాధ్యమయ్యే విభిన్న ఆకృతీకరణలు CLMS డేటాసెట్‌లో గమనించిన విధంగానే అనేక పరస్పర చర్యలను వెల్లడించాయి.మా పద్ధతి యొక్క ప్రధాన బలాలలో ఒకటి, ఇది HLA వంటి అత్యంత పాలిమార్ఫిక్ జన్యువులను పరస్పరం సులభంగా గుర్తించడాన్ని అనుమతిస్తుంది, కాబట్టి అధ్యయనం చేయడం కష్టంగా ఉండే HLA హాప్లోటైప్-నిర్దిష్ట ప్రోటీన్‌ల పరస్పర చర్యలను అధ్యయనం చేయడం ఆసక్తికరంగా ఉంటుంది.కలిసి చూస్తే, ఇంటర్ఫెరాన్-ప్రేరిత సిగ్నలింగ్ నెట్‌వర్క్‌లపై మన అవగాహనను విస్తరించడానికి మరియు కణితి సూక్ష్మ వాతావరణంలో మరింత సంక్లిష్టమైన ఇంటర్ సెల్యులార్ సిస్టమ్‌లను అధ్యయనం చేయడానికి CLMS ఉపయోగపడుతుందని మా డేటా నిరూపిస్తుంది.
ఫ్లో-1 కణాలు ATCC నుండి పొందబడ్డాయి మరియు 1% పెన్సిలిన్/స్ట్రెప్టోమైసిన్ (ఇన్విట్రోజెన్), 10% పిండం బోవిన్ సీరం (గిబ్కో)తో అనుబంధంగా DMEM (గిబ్కో)లో నిర్వహించబడ్డాయి మరియు 37°C మరియు 5% CO2 వద్ద నిల్వ చేయబడ్డాయి.ఇంక్యుబేషన్.IFNα14 (ఎడిన్‌బర్గ్ ప్రొటీన్ ప్రొడక్షన్ ఫెసిలిటీచే తయారు చేయబడింది)తో చికిత్స చేయడానికి ముందు కణాలు 70-80% సంగమానికి పెరిగాయి.అన్ని ఇతర రసాయనాలు మరియు కారకాలు గుర్తించబడకపోతే సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్ నుండి కొనుగోలు చేయబడ్డాయి.
ఫ్లో-1 కణాలు 6-బావి పలకలలో కల్చర్ చేయబడ్డాయి మరియు మరుసటి రోజు కణాలు 10 ng/ml IFNα14తో 24 గంటల పాటు సుమారు 80% సంగమం వరకు చికిత్స చేయబడ్డాయి.కణాలు PBSతో మూడుసార్లు కడిగి, తాజాగా తయారు చేయబడిన DSS (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) (DMSOలో కరిగినవి)తో PBSలో 37° C. వద్ద 5 నిమిషాల పాటు తుది సాంద్రత 0.5 mM వరకు లిగేట్ చేయబడ్డాయి.DSS క్రాస్‌లింకింగ్ ప్రతిచర్య PBSతో భర్తీ చేయబడింది మరియు 37°C వద్ద 15 నిమిషాలకు PBSలో 20 mM Tris (pH 8.0)ని జోడించడం ద్వారా అవశేష DSS చల్లార్చబడింది.కణాలు స్క్రాప్ చేయడం ద్వారా సేకరించబడ్డాయి మరియు తక్కువ బైండింగ్ ట్యూబ్‌లలో (ఆక్సిజన్) సేకరించబడ్డాయి.
సెల్ గుళికలు 300 µl యూరియా లైసిస్ బఫర్ (8 M యూరియా, 0.1 M ట్రిస్, pH 8.5)తో 30 నిమిషాల పాటు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద అప్పుడప్పుడు వణుకుతూ ఉంటాయి.అన్ని సెంట్రిఫ్యూగేషన్ దశలు 8 ° C వద్ద 14,000 xg వద్ద నిర్వహించబడ్డాయి.10 నిమిషాల పాటు లైసేట్‌ను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, సూపర్‌నాటెంట్‌ను కొత్త ట్యూబ్‌కి బదిలీ చేయండి.మిగిలిన స్పష్టమైన కణాలు 150 μl రెండవ లైసిస్ బఫర్‌లో (2 M యూరియా, 2% (w/v) SDS (సోడియం డోడెసిల్ సల్ఫేట్)) 30 నిమిషాలు లేదా అంతకంటే ఎక్కువ సజాతీయ సజల ద్రావణాన్ని పొందే వరకు కరిగించబడతాయి.లైసేట్ 20 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు సూపర్‌నాటెంట్ మునుపటి దశలో పొందిన లైసేట్‌తో కలపబడింది.మైక్రోప్లేట్ విధానాల కోసం తయారీదారు సూచనల ప్రకారం మైక్రో BCA అస్సే (థర్మో ఫిషర్ సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ సాంద్రతలు అంచనా వేయబడ్డాయి.నమూనాలు త్వరగా ద్రవ నత్రజనిలో స్తంభింపజేయబడ్డాయి మరియు -80 ° C వద్ద నిల్వ చేయబడతాయి.
Wisniewski మరియు ఇతరులు వివరించిన విధంగా సుమారు 100 μg కరిగే క్రాస్-లింక్డ్ ప్రోటీన్ సవరించబడిన వడపోత నమూనా తయారీ ప్రోటోకాల్ (FASP) ఉపయోగించి ప్రాసెస్ చేయబడింది.69 క్లుప్తంగా, ప్రోటీన్ 200 µl యూరియా బఫర్‌తో క్రాస్‌లింక్ చేయబడింది (0.1 M ట్రిస్‌లో 8 M యూరియా, pH 8.5), సుడిగుండం మరియు సగానికి తగ్గించబడింది.అన్ని సెంట్రిఫ్యూగేషన్ దశలు 25 ° C వద్ద 14,000 xg వద్ద నిర్వహించబడ్డాయి.క్రాస్-లింక్డ్ ప్రొటీన్ లైసేట్ యొక్క మొదటి సగం అల్ట్రాసెల్-10 మెమ్బ్రేన్ (మెర్క్)తో కూడిన 10 kDa మైక్రోకాన్ సెంట్రిఫ్యూగల్ ఫిల్టర్ పరికరానికి బదిలీ చేయబడింది, తర్వాత ఫిల్టర్‌పై 25 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయబడింది.అప్పుడు ఫిల్టర్‌కు ప్రోటీన్ యొక్క రెండవ సగం జోడించండి మరియు అదే దశలను పునరావృతం చేయండి.యూరియా బఫర్‌లో 100 μl 17 mM ట్రిస్ (2-కార్బాక్సీథైల్) ఫాస్ఫైన్ హైడ్రోక్లోరైడ్ (TCEP) జోడించడం ద్వారా ప్రోటీన్ రికవరీ జరిగింది.రికవరీ థర్మోమిక్సర్‌లో 600 rpm వద్ద 30 నిమిషాల పాటు 37°C వద్ద కదిలించబడింది.అదనంగా, కాలమ్ సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు యూరియా బఫర్‌లో 100 μl 50 mM iodoacetamide ఉపయోగించి తగ్గిన క్రాస్-లింక్డ్ ప్రోటీన్ ఆల్కైలేట్ చేయబడింది.ఆల్కైలేషన్ ప్రతిచర్య గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద చీకటిలో 20 నిమిషాలు నిర్వహించబడింది.నిలువు వరుసను తిప్పండి, 100 µl యూరియా బఫర్‌తో నిలువు వరుస గోడలను 3 సార్లు కడగాలి, ఆపై సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయండి.అదే ఆపరేషన్ 100 μl 100 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ ఉపయోగించి 3 సార్లు జరిగింది.ట్రిప్సినైజేషన్ ముందు, సేకరణ ట్యూబ్‌ను కొత్త దానితో భర్తీ చేయండి.50 mM అమ్మోనియం బైకార్బోనేట్ మరియు 1 µl ట్రిప్సిన్ ట్రిప్సిన్ బఫర్ (ప్రోమెగా)లో కరిగించబడిన జీర్ణక్రియ బఫర్‌ను జోడించండి.ట్రిప్సిన్ మరియు ప్రోటీన్ నిష్పత్తి సుమారు 1:33 వద్ద నిర్వహించబడుతుంది మరియు జీర్ణక్రియ ప్రతిచర్యలు రాత్రిపూట తేమతో కూడిన గదిలో 37 ° C. వద్ద పొదిగేవి.క్రాస్‌లింక్ చేయబడిన పెప్టైడ్ 25 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ ద్వారా ఫిల్టర్ నుండి తొలగించబడింది.ఫిల్టర్‌కు 50 μl 0.5 M NaCl జోడించడం ద్వారా పెప్టైడ్ రికవరీ మెరుగుపరచబడింది, తర్వాత 25 నిమిషాల పాటు సెంట్రిఫ్యూగేషన్ చేయబడింది.
C18 మైక్రో స్పిన్ నిలువు వరుసలు (హార్వర్డ్ ఉపకరణం) చిన్న మార్పులతో బౌచల్ మరియు ఇతరులు 70 వివరించిన ప్రోటోకాల్‌ను అనుసరించి క్రాస్-లింక్డ్ ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌లను డీసాల్ట్ చేయడానికి ఉపయోగించారు.క్లుప్తంగా, అసిటోనిట్రైల్ (AcN) (మెర్క్)లో 0.1% ఫార్మిక్ యాసిడ్ (FA) యొక్క మూడు వాష్‌లు మరియు 0.1% FA యొక్క రెండు వాష్‌లతో C18 స్పిన్ నిలువు వరుసలు సక్రియం చేయబడ్డాయి.కాలమ్ 15 నిమిషాల పాటు 0.1% FAతో హైడ్రేట్ చేయబడింది.నమూనాలను స్పిన్ నిలువు వరుసలలోకి లోడ్ చేయండి మరియు 0.1% FAతో 3 సార్లు కడగాలి.డీసాల్టెడ్ పెప్టైడ్‌లు 0.1% FAలో 50%, 80% మరియు 100% AcNని ఉపయోగించి స్టెప్‌వైస్ గ్రేడియంట్‌తో వరుసగా తొలగించబడ్డాయి.అవశేష ద్రవం పూర్తిగా అదృశ్యమయ్యే వరకు నమూనాలను స్పీడ్‌వాక్ ప్లస్ కాన్సంట్రేటర్ (ఎప్పెండోర్ఫ్)లో ఎండబెట్టారు.ఎలుటెడ్ పెప్టైడ్‌లు 2.5% AcNలో 100 μl 0.08% ట్రైఫ్లోరోఅసిటిక్ యాసిడ్‌లో కరిగించబడ్డాయి మరియు నానోడ్రాప్ 2000 (థర్మో సైంటిఫిక్)లో సాంద్రతలు కొలుస్తారు.ప్రతి నమూనాకు సుమారు 1 μg క్రాస్‌లింక్డ్ పెప్టైడ్ LC-MS/MS సిస్టమ్‌లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడింది.
ఆర్బిట్రాప్ ఎక్స్‌ప్లోరిస్ 480 మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో సైంటిఫిక్)కి అనుసంధానించబడిన అల్టిమేట్ 3000 RSLCnano LC సిస్టమ్ (థర్మో సైంటిఫిక్)పై క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు వేరు చేయబడ్డాయి.C18 PepMap100 సోర్బెంట్ మరియు 5 µm PepMap సోర్బెంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్)తో ప్యాక్ చేయబడిన 300 µm ID, 5 mm పొడవు గల µ-ప్రీ-కాలమ్ C18 క్యాప్చర్ కాలమ్‌పై క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు సేకరించబడ్డాయి.పంప్ ఫ్లో సెట్‌ను 5 µl/min వద్ద లోడ్ చేయండి 0.08% ట్రిఫ్లోరోఅసిటిక్ యాసిడ్ 2.5% AcNలో కరిగిపోతుంది.క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు 75 μm లోపలి వ్యాసం మరియు 150 మిమీ పొడవుతో విశ్లేషణాత్మక ఫ్యూజ్డ్ సిలికా కాలమ్‌పై వేరు చేయబడ్డాయి, 2 μm పెప్‌మ్యాప్ సోర్బెంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్)తో నింపబడ్డాయి.మొబైల్ దశలు A మరియు B వరుసగా నీటిలో 0.1% FA మరియు అసిటోనిట్రైల్‌లో 0.1% FA కలిగి ఉంటాయి.ప్రవణత 2.5% B వద్ద ప్రారంభమవుతుంది మరియు 90 నిమిషాలలో 40% Bకి, తర్వాతి 2 నిమిషాల్లో 90% Bకి పెరుగుతుంది.మొబైల్ ఫేజ్ కంపోజిషన్ 10 నిమిషాలకు 90% B వద్ద నిర్వహించబడింది మరియు తర్వాత 2 నిమిషాల్లో 2.5% Bకి సరళంగా తగ్గింది.తదుపరి చక్రానికి ముందు 8 నిమిషాల పాటు నిలువు వరుస 2.5% B వద్ద సమతౌల్యం చేయబడింది.విశ్లేషణాత్మక కాలమ్ నుండి తొలగించబడిన క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్‌లు నానోఎలెక్ట్రోస్ప్రే అయనీకరణ (NSI) మూలంలో అయనీకరణం చేయబడ్డాయి మరియు ఎక్స్‌ప్లోరిస్ 480 మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో సైంటిఫిక్)లోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.
ఆర్బిట్రాప్ ఎక్స్‌ప్లోరిస్ 480 మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ పాజిటివ్ డేటా కోరిలేషన్ మోడ్‌లో పని చేస్తుంది.m/z 350 Th నుండి m/z 2000 Th వరకు పరిధి సెట్టింగ్‌లతో 120,000 రిజల్యూషన్‌తో సెక్షన్ మోడ్‌లో పూర్తి స్కాన్ నిర్వహించబడింది.సాధారణీకరించిన AGC లక్ష్యం 50ms గరిష్ట ఇన్‌పుట్ సమయంతో 300% వద్ద సెట్ చేయబడింది.పెప్టైడ్‌ల కోసం మోనోఐసోటోపిక్ పీక్ డిటెక్షన్ ఏర్పాటు చేయబడింది.చాలా తక్కువ పూర్వగాములు కనుగొనబడితే పరిమితి సడలింపు పరామితి ఒప్పుకు సెట్ చేయబడుతుంది.పూర్వగామి యొక్క కనీస అయానిక్ బలం 5.0e3కి సెట్ చేయబడింది మరియు +8 వరకు పూర్వగామి ఛార్జ్ స్థితులు ప్రయోగాలలో చేర్చబడ్డాయి.
డేటా కోరిలేషన్ మోడ్‌లో ప్రధాన స్కాన్‌ల మధ్య సైకిల్ సమయం 2.5 సెకన్లకు సెట్ చేయబడింది.పూర్వగామి అయాన్ యొక్క మొదటి ఫ్రాగ్మెంటేషన్ తర్వాత డైనమిక్ మాస్ మినహాయింపు 20 సెకన్లకు సెట్ చేయబడింది.పూర్వగామి ఐసోలేషన్ విండో 2 వకి సెట్ చేయబడింది.డేటా ఆధారిత MS/MS స్కాన్‌లో స్థిర తాకిడి శక్తి మోడ్‌తో సాధారణీకరించబడిన తాకిడి శక్తి రకం ఎంపిక చేయబడింది.తాకిడి శక్తి 30%కి సెట్ చేయబడింది.ఆర్బిట్రాప్ రిజల్యూషన్ 15,000కి మరియు AGC లక్ష్యం 100%కి సెట్ చేయబడింది.అనుకూల గరిష్ట ఇంజెక్షన్ సమయం 60 మిల్లీసెకన్లకు సెట్ చేయబడింది.
క్రాస్-లింక్డ్ శాంపిల్స్‌లో ప్రోటీన్-ప్రోటీన్ నెట్‌వర్క్‌ను ట్రాక్ చేసే ముందు, నమూనాలలో గుర్తించదగిన పెప్టైడ్‌లు/ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడానికి మేము MaxQuant ప్యాకేజీ (వెర్షన్ 1.6.12.0)26,27 ఉపయోగించి ముడి ఫైల్‌లను ప్రాసెస్ చేసాము.అదనంగా, IFNαతో చికిత్స చేయబడిన మరియు చికిత్స చేయని క్రాస్‌లింక్ చేయని ఫ్లో-1 నమూనాలపై ఇలాంటి ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణలు జరిగాయి.అంతర్నిర్మిత శోధన ఇంజిన్ Andromeda27ని ఉపయోగించి MS/MS డేటా UniProt హ్యూమన్ డేటాబేస్ (www.uniprot.org)లో (ఆగస్టు 12, 2020న అప్‌లోడ్ చేయబడింది, 75,093 ఎంట్రీలను కలిగి ఉంది) శోధించబడింది.ఎంజైమ్ యొక్క విశిష్టత మరియు డీమిడేషన్ (N, Q) మరియు ఆక్సీకరణ (M) యొక్క వివిధ మార్పులను సూచించకుండా శోధన జరిగింది.పూర్వగామి మాస్ టాలరెన్స్‌లు 20 ppm వద్ద మరియు ఉత్పత్తి అయాన్లు 0.02 Da వద్ద సెట్ చేయబడ్డాయి.ప్రారంభ మరియు గరిష్ట ద్రవ్యరాశి విచలనం 10 ppmకి సెట్ చేయబడింది.పెప్టైడ్ యొక్క గరిష్ట ద్రవ్యరాశి 4600 Da వద్ద సెట్ చేయబడింది మరియు సీక్వెన్స్ సారూప్యత 7 మరియు 25 అమైనో ఆమ్లాల (aa) మధ్య సెట్ చేయబడింది.పెర్సియస్ ప్రోగ్రామ్ (వెర్షన్ 1.6.10.45) ఉపయోగించి మరింత గణాంక విశ్లేషణ జరిగింది.ప్రోటీన్ యొక్క స్పెక్ట్రల్ తీవ్రతను సాధారణీకరించడం ద్వారా ప్రోటీన్ కంటెంట్ లెక్కించబడుతుంది (LFQ తీవ్రత; లేబుల్ చేయని పరిమాణం) 27 మరియు తీవ్రత విలువలు లాగ్ 2కి మార్చబడ్డాయి.R (v 4.1.2)లోని ఫీట్‌మ్యాప్ (v1.0.12) ప్యాకేజీని ఉపయోగించి వాటి పెప్టైడ్ తీవ్రత ద్వారా గుర్తించబడిన ప్రోటీన్‌ల యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ నిర్మించబడింది.చికిత్స చేయని నమూనాలతో పోలిస్తే నాలుగు రెట్లు ఎక్కువ యాక్టివేట్ చేయబడిన IFNα- చికిత్స చేసిన ప్రోటీన్‌ల కోసం రియాక్టోమ్ పాత్వే డేటాబేస్ ఉపయోగించి పాత్‌వే సుసంపన్నత విశ్లేషణ జరిగింది.
LC-MS/MS ద్వారా పర్యవేక్షించబడే ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌ల యొక్క లైసిన్ (K) లేదా సెరైన్ (S) నిర్దిష్ట రసాయన క్రాస్‌లింక్‌ల గుర్తింపు క్రాస్-లింక్డ్ పెప్టైడ్స్ (SIM-XL) 29 కోసం స్పెక్ట్రోస్కోపిక్ ఐడెంటిఫికేషన్ మెషీన్ (SIM-XL) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది.మొదట, ఇంటర్ఫెరాన్-అనుబంధ (IFN) DNA నష్టం నిరోధక సంతకం (IRDS) జన్యువుల మధ్య సాధ్యమయ్యే పరస్పర చర్యలు పదరియా మరియు ఇతరులు 28లో వివరించిన IRDS ప్రోటీన్ డేటాసెట్‌ను ఉపయోగించి పరిశోధించబడ్డాయి.మొత్తం మానవ UniProt యొక్క అన్ని షరతులు మరియు పునరావృతాలను స్క్రీనింగ్ చేయడం గణనపరంగా ఇంటెన్సివ్, కాబట్టి మొత్తం మానవ UniProt డేటాబేస్ (www.uniprot.org) (12 ఆగస్టు 2020న డౌన్‌లోడ్ చేయబడింది, IFNα- చికిత్స చేసిన రిపీట్‌లకు వ్యతిరేకంగా 75,093 ఎంట్రీలు ఉన్నాయి).అధిక విశ్వసనీయ పరస్పర చర్యల కోసం ఫిల్టర్‌లలో ఒకటి.పొందిన ఈ అధిక-ప్రాముఖ్యత పరస్పర చర్యలు అన్ని పునరావృత్తులు మరియు పరిస్థితులలో విస్తరించబడ్డాయి మరియు పరీక్షించబడ్డాయి.
SIM-XLలో, క్రాస్‌లింకర్ (XL) కోసం DSS ఉపయోగించబడింది మరియు XL వెయిట్ షిఫ్ట్ మరియు సవరణ వెయిట్ షిఫ్ట్ వరుసగా 138.06 మరియు 156.07కి సెట్ చేయబడ్డాయి.కింది క్రాస్‌లింకింగ్ రియాక్షన్ సైట్‌లు పరిగణించబడతాయి: KK, KS మరియు KN-TERM, రిపోర్టర్ అయాన్‌లు లేకుండా.పూర్వగామి మరియు ఫ్రాగ్మెంట్ ppm రెండూ 20కి సెట్ చేయబడ్డాయి మరియు Xrea థ్రెషోల్డ్ 0.15కి సెట్ చేయబడింది.ట్రిప్సిన్ పూర్తిగా నిర్దిష్టమైనదిగా పరిగణించబడింది మరియు అధిక-శక్తి C-ట్రాప్ (HCD) ఫ్రాగ్మెంటేషన్ పద్ధతి అమలు చేయబడింది.XCorr డైనమిక్ DB తగ్గింపు థ్రెషోల్డ్ మరియు డైనమిక్ DB తగ్గింపు కోసం పెప్టైడ్‌ల కనీస సంఖ్య వరుసగా 2.5 మరియు 2కి సెట్ చేయబడ్డాయి.ఇతర పారామితులు: మోనోఐసోటోప్ సంభావ్యత మరియు గరిష్ట యాదృచ్ఛిక కటాఫ్, స్ట్రాండ్‌కు కనిష్టంగా 4 AA అవశేషాలు మరియు గరిష్ట స్ట్రాండ్ ఛార్జ్, మరియు 3 గరిష్టంగా మిస్డ్ స్ప్లిట్‌లు.ఫలితంగా కుట్టిన 2D మ్యాప్‌లు (SIM-XL)లో విశ్లేషించబడ్డాయి మరియు 2D మ్యాప్‌లను రూపొందించడానికి xQuest28 గ్రాఫికల్ ప్రాతినిధ్యం ఉపయోగించబడింది.ప్రోటీన్ నిర్మాణాలపై ప్రోటీన్ క్రాస్‌లింక్‌లు PyMol (PyMOL మాలిక్యులర్ గ్రాఫిక్స్ సిస్టమ్, వెర్షన్ 2.0 ష్రోడింగర్, LLC)లో అందించబడ్డాయి.
"హిడెన్ మార్కోవ్ మెథడ్" యొక్క హోమోలజీ మోడలింగ్ మరియు అమలు సూత్రాలను ఉపయోగించి Phyre2 సర్వర్ (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ఉపయోగించి ప్రోటీన్ మోడల్ నిర్మాణాలు సృష్టించబడ్డాయి.ఫైర్ 2 తెలిసిన ప్రోటీన్ నిర్మాణాలతో సీక్వెన్స్ అలైన్‌మెంట్ ఆధారంగా మోడల్ స్ట్రక్చర్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తుంది.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 మరియు MDN1 ప్రోటీన్‌ల కోసం, టెంప్లేట్ నిర్మాణాలు 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 మరియు 6i2665 ఉపయోగించబడ్డాయి.అదనంగా, AlphaFold71 MX1, UBP18 మరియు ROBO1 యొక్క నిర్మాణం కూడా పరిగణించబడింది.BIOVIA డిస్కవరీ స్టూడియో విజువలైజర్ ప్యాకేజీ (డస్సాల్ట్ సిస్టమ్స్, BIOVIA, శాన్ డియాగో, CA, USA) మరియు మాలిక్యులర్ ఆపరేటింగ్ ఎన్విరాన్‌మెంట్ ప్యాకేజీ (MOE; కెమికల్ కంప్యూటింగ్ గ్రూప్ ఇంక్., మాంట్రియల్, క్యూబెక్, కెనడా) ఉపయోగించి ప్రోటీన్ నిర్మాణం దృశ్యమానం చేయబడింది.