ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 డ్యూప్లెక్స్ వెల్డెడ్ ట్యూబ్ ఫర్ కెమికల్ ఇండస్ట్రీ కెమికల్ కాంపోనెంట్, SPECC1L యొక్క లోపం స్ప్లైస్డ్ జాయింట్స్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని పెంచడానికి మరియు కపాల నాడీ క్రెస్ట్ కణాల తగ్గింపుకు దారితీస్తుంది.

Nature.comని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు.మీరు పరిమిత CSS మద్దతుతో బ్రౌజర్ సంస్కరణను ఉపయోగిస్తున్నారు.ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు నవీకరించబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాల్సిందిగా మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా Internet Explorerలో అనుకూలత మోడ్‌ని నిలిపివేయండి).అదనంగా, కొనసాగుతున్న మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా సైట్‌ని చూపుతాము.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 రసాయన పరిశ్రమ కోసం డ్యూప్లెక్స్ వెల్డెడ్ ట్యూబ్

లియోచెంగ్ సిహే SS మెటీరియల్ కో., లిమిటెడ్.స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ అతుకులు లేని పైపులు, ప్రకాశవంతమైన ఎనియల్డ్ ట్యూబ్‌లు, అతుకులు లేని కాయిల్డ్ గొట్టాలు మొదలైన వాటిలో ప్రత్యేకత కలిగిన ప్రముఖ తయారీదారు.కస్టమర్‌లను సులభతరం చేయడానికి, మేము పైపులు మరియు ట్యూబ్‌లను కూడా వెల్డింగ్ చేసాము.లియోచెంగ్ సిహే SS మెటీరియల్ కో., లిమిటెడ్.అత్యంత అధునాతన ఉత్పత్తి మరియు పరీక్షా పరికరాలను కలిగి ఉంది.మేము మీ అవసరాన్ని పూర్తిగా తీర్చగలము.ప్రమాణం ప్రకారం చాలా ఖచ్చితంగా , మేము ఉత్పత్తి చేసే ట్యూబ్‌లు ఎల్లప్పుడూ సరైన OD మరియు WT టాలరెన్స్‌ని కలిగి ఉంటాయి.టాలరెన్స్ నియంత్రణ ఖచ్చితంగా ఉత్పత్తి ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.మా ఉత్పత్తులు ఎల్లప్పుడూ కస్టమర్‌లతో సంతృప్తి చెందుతాయి.మా ఉత్పత్తులను కొనుగోలు చేసిన కస్టమర్‌లు మరిన్ని లాభాలను సృష్టించారు.
ఎ) OD (బయటి వ్యాసం) : 3.18mm నుండి 101.6mm
బి) WT (గోడ మందం) : 0.5mm నుండి 20mm
సి) పొడవు : కస్టమర్ యొక్క అవసరం ప్రకారం
d) ప్రమాణాలు : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 మొదలైనవి
ఇ) ప్రక్రియ విధానం: ERW, EFW మొదలైనవి

స్లైడర్‌లు ఒక్కో స్లయిడ్‌కు మూడు కథనాలను చూపుతున్నాయి.స్లయిడ్‌ల ద్వారా తరలించడానికి వెనుక మరియు తదుపరి బటన్‌లను ఉపయోగించండి లేదా ప్రతి స్లయిడ్ ద్వారా తరలించడానికి చివర ఉన్న స్లయిడ్ కంట్రోలర్ బటన్‌లను ఉపయోగించండి.
క్రానియల్ న్యూరల్ క్రెస్ట్ సెల్స్ (CNCC) పిండ నాడీ మడతలను తగ్గించి, ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌లకు వలసపోతాయి, ఇవి చాలా మధ్య ముఖ నిర్మాణాలను ఏర్పరుస్తాయి.CNCC పనిచేయకపోవడం అనేది ఓరోఫేషియల్ క్లెఫ్ట్ యొక్క ఎటియాలజీలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తుంది, ఇది ఒక సాధారణ పుట్టుకతో వచ్చే వైకల్యం.విలక్షణమైన మరియు సిండ్రోమిక్ చీలికలు ఉన్న రోగులలో హెటెరోజైగస్ SPECC1L ఉత్పరివర్తనలు కనుగొనబడ్డాయి.ఇక్కడ, మేము కల్చర్డ్ SPECC1L నాక్‌డౌన్ సెల్‌లలో కానానికల్ అడెసివ్ జంక్షన్ (AJ) కాంపోనెంట్స్, β-కాటెనిన్ మరియు E-క్యాథరిన్ యొక్క మెరుగైన మరకలను నివేదిస్తాము మరియు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు AJ యొక్క అపికల్-బేసల్ డిఫ్యూజన్‌ను చూపుతాయి.క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌లో SPECC1L పాత్రను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము Specc1l లోపం ఉన్న మౌస్ మోడల్‌ని సృష్టించాము.హోమోజైగస్ మార్పుచెందగలవారు పిండం ప్రాణాంతకం మరియు బలహీనమైన న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేత మరియు CNCC లామినేషన్‌ను ప్రదర్శిస్తారు.మ్యూటాంట్ న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లో AJ ప్రోటీన్ స్టెయినింగ్ పెరుగుతుంది.ఈ AJ లోపం CNCC డీలామినేషన్‌లో లోపంతో స్థిరంగా ఉంది, AJ రద్దు అవసరం.అదనంగా, Specc11 మార్పుచెందగలవారు PI3K-AKT సిగ్నలింగ్‌ను తగ్గించారు మరియు అపోప్టోసిస్‌ను పెంచారు.విట్రోలో, వైల్డ్-టైప్ కణాలలో PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ యొక్క తేలికపాటి నిరోధం AJ మార్పులను ప్రేరేపించడానికి సరిపోతుంది.ముఖ్యముగా, SPECC1L నాక్‌డౌన్ ద్వారా ప్రేరేపించబడిన AJ మార్పులను PI3K-AKT పాత్‌వే సక్రియం చేయడం ద్వారా మార్చవచ్చు.కలిసి చూస్తే, ఈ డేటా SPECC1L, PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ మరియు AJ జీవశాస్త్రం యొక్క నవల నియంత్రకంగా, న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేత మరియు CNCC స్తరీకరణకు అవసరమని సూచిస్తుంది.
క్రానియల్ న్యూరల్ క్రెస్ట్ సెల్స్ (CNCCలు) డోర్సల్ న్యూరోఎక్టోడెర్మ్‌కు స్థానీకరించబడతాయి మరియు ఎపిథీలియల్-మెసెన్చైమల్ ట్రాన్సిషన్ (EMT) 1,2,3తో కూడిన ప్రక్రియ ద్వారా అభివృద్ధి చెందుతున్న న్యూరల్ ఫోల్డ్‌ల యొక్క న్యూరోపీథీలియం నుండి వేరు చేయబడతాయి.ప్రీమిగ్రేటింగ్ ఎపిథీలియల్ CNCCలు ఇంటర్ సెల్యులార్ జంక్షన్‌లకు అంతరాయం కలిగిస్తాయి మరియు మొదటి మరియు రెండవ ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌లను నింపి, క్రానియోఫేషియల్ మృదులాస్థిని ఏర్పరిచే మెసెన్చైమల్ CNCCలుగా మారతాయి.అందువల్ల, CNCC పనితీరును నియంత్రించే జన్యువులు ఓరోఫేషియల్ క్లెఫ్ట్స్ వంటి క్రానియోఫేషియల్ పుట్టుకతో వచ్చే క్రమరాహిత్యాల ఎటియాలజీలో తరచుగా అంతరాయం కలిగిస్తాయి, సాధారణంగా USలో మాత్రమే 1/800 జననాలను ప్రభావితం చేస్తాయి.పుట్టుకతో వచ్చే వైకల్యాల్లో ఒకటి8.
CNCC యొక్క డీలామినేషన్ ఎలుకలలో పిండం అభివృద్ధి 8.5 మరియు 9.5 రోజుల మధ్య పూర్వ నాడీ ట్యూబ్ మూసివేయడంతో సమానంగా ఉంటుంది.అనేక మౌస్ ఓరోఫేషియల్ క్లెఫ్ట్-అనుబంధ జన్యువుల మార్పుచెందగలవారు కూడా Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 మరియు Pdgfrα12తో సహా కొన్ని రకాల న్యూరల్ ట్యూబ్ లోపాన్ని ప్రదర్శిస్తారు.అయినప్పటికీ, నాడీ ట్యూబ్ మూసివేత మరియు CNCC స్తరీకరణ ప్రక్రియలు స్వతంత్రంగా పరిగణించబడతాయి, ఎందుకంటే స్ప్లాచ్ మ్యూటాంట్ మౌస్ (Pax3) CNCC స్ట్రాటిఫికేషన్ లేదా మైగ్రేషన్ 13,14పై ఎటువంటి ప్రభావం లేకుండా న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేతలో లోపాలను ప్రదర్శిస్తుంది.CNCC డిసెక్షన్ మరియు న్యూరల్ ట్యూబ్ క్లోజర్‌లో లోపాలతో కూడిన అదనపు మౌస్ మోడల్‌లు ఈ రెండు ప్రక్రియల యొక్క సాధారణ పరమాణు ప్రాతిపదికను వివరించడంలో సహాయపడతాయి.
న్యూరోపీథీలియల్ కణాల నుండి CNCCని వేరుచేయడానికి అంటుకునే జంక్షన్‌ల (AJలు) రద్దు అవసరం, ఇవి ప్రోటీన్ కాంప్లెక్స్‌లతో కూడి ఉంటాయి, ఇతర వాటిలో, E-క్యాథరిన్, β-కాటెనిన్, α-E-కాటెనిన్ మరియు ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్‌తో అనుబంధించబడిన α-ఆక్టినిన్ 2. ఓవర్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ స్టడీస్ న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లోని ఇ-క్యాథరిన్ CNCC డీలామినేషన్‌లో తగ్గింపు లేదా ఆలస్యం చూపించింది.దీనికి విరుద్ధంగా, E-క్యాథరిన్ యొక్క అణచివేత ప్రారంభ స్తరీకరణకు దారితీస్తుంది15,16.CNCC స్తరీకరణ సమయంలో EMTకి మధ్యవర్తిత్వం వహించే అనేక అంశాలు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) మరియు మాతృక మెటాలోప్రొటీనేసెస్ (MMPలు) వంటి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మ్యాట్రిక్స్ (ECM) రీమోడలింగ్ ప్రొటీన్‌లు, అయితే AJCCలు ప్రత్యక్ష నియంత్రణలు ఇంకా తెలియలేదు.PI3K-AKT మార్గం E-క్యాథరిన్ స్థాయిలను వ్యతిరేకిస్తుంది, ప్రధానంగా క్యాన్సర్ పరిశోధన నుండి.ఎలుకలలో PDGFα-ఆధారిత PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ కోల్పోవడం క్రానియోఫేషియల్ అసాధారణతలకు దారితీస్తుందని ఇటీవలి అధ్యయనాలు చూపించాయి, వీటిలో చీలిక అంగిలి మరియు న్యూరల్ ట్యూబ్ లోపాలు ఉన్నాయి.అయినప్పటికీ, CNCC స్తరీకరణపై PI3K-AKT మార్గం మరియు AJ స్థిరత్వం మధ్య సంబంధం అస్పష్టంగా ఉంది.
నోటి నుండి కంటి వరకు విస్తరించి ఉన్న తీవ్రమైన చీలిక ఉన్న ఇద్దరు వ్యక్తులలో SPECC1Lని మొదటి ఉత్పరివర్తన జన్యువుగా మేము గతంలో గుర్తించాము, దీనిని ఏటవాలు చీలిక (ObFC) లేదా Tessier IV18 క్లెఫ్ట్ అని పిలుస్తారు.SPECC1L ఉత్పరివర్తనలు ఆటోసోమల్ డామినెంట్ ఓపిట్జ్ G/BBB సిండ్రోమ్ (OMIM #145410)తో ఉన్న రెండు బహుళజాతి కుటుంబాలలో గుర్తించబడ్డాయి, దీనిలో ప్రభావితమైన వ్యక్తులు హైపర్‌డిస్టెన్స్ మరియు చీలిక పెదవి/అంగాన్ని ప్రదర్శించారు19, మరియు ఒక కుటుంబంలో టిబి ఓవర్‌డిస్టెన్స్ సిండ్రోమ్ ( OMIM #120454020) .Opitz G/BBB సిండ్రోమ్ యొక్క సగానికి పైగా కేసులు X- లింక్డ్ (OMIM #300000) మరియు MID1 జన్యువులోని ఉత్పరివర్తనాల వల్ల సంభవిస్తాయి, ఇది మైక్రోటూబ్యూల్-అనుబంధ కణ అస్థిపంజరం యొక్క ప్రోటీన్ 22 ను ఎన్కోడ్ చేస్తుంది.SPECC1L, మైక్రోటూబ్యూల్స్ మరియు ఆక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్‌తో అనుబంధించబడిన ప్రోటీన్, కణ సంశ్లేషణ మరియు వలస 18 సమయంలో యాక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్ పునర్నిర్మాణానికి అవసరమైన సిగ్నలింగ్‌కు మధ్యవర్తిత్వం వహించవచ్చని మేము ఊహిస్తున్నాము.ఇన్ విట్రో మరియు ఇన్ వివో అధ్యయనాల ద్వారా, మేము ఇప్పుడు SPECC1Lని PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ ద్వారా AJ స్థిరత్వం యొక్క నవల నియంత్రకంగా వివరిస్తాము.సెల్యులార్ స్థాయిలో, SPECC1L లోపం ఫలితంగా పాన్-AKT ప్రోటీన్ స్థాయి తగ్గుతుంది మరియు AJ యొక్క ఎపికల్-బేసల్ డిస్పర్షన్‌లో పెరుగుదల ఏర్పడింది, ఇది AKT పాత్వే యొక్క రసాయన క్రియాశీలత ద్వారా తొలగించబడింది.వివోలో, స్పెక్11-లోపం ఉన్న పిండాలు బలహీనమైన న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేతను చూపుతాయి మరియు CNCC విభజనను తగ్గించాయి.ఈ విధంగా, SPECC1L ఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్ సమయంలో సాధారణ CNCC ఫంక్షన్‌కు అవసరమైన అత్యంత నియంత్రిత కణ సంశ్లేషణ-ఆధారిత సిగ్నలింగ్‌లో పనిచేస్తుంది.
సెల్యులార్ స్థాయిలో SPECC1L పాత్రను వర్గీకరించడానికి, మేము SPECC1L18లో గతంలో వివరించిన స్థిరమైన ఆస్టియోసార్కోమా సెల్ లైన్ U2OS లోపాన్ని ఉపయోగించాము.SPECC1L (kd) నాక్‌డౌన్‌తో ఉన్న ఈ స్థిరమైన U2OS సెల్‌లు SPECC1L ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రొటీన్‌ల స్థాయిలలో ఒక మోస్తరు (60–70%) తగ్గుదలని కలిగి ఉన్నాయి, అలాగే ఆక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్ యొక్క వలస మరియు పునర్వ్యవస్థీకరణలో లోపాలతో పాటుగా 18. దీనికి విరుద్ధంగా, తీవ్రమైన తాత్కాలిక తగ్గుదల SPECC1L మైటోటిక్ లోపాలకు దారితీస్తుందని చూపబడింది 23 .మరింత క్యారెక్టరైజేషన్ తరువాత, మా స్థిరమైన SPECC1L-kd కణాలు చాలా ఎక్కువ సంగమం వద్ద పదనిర్మాణాన్ని మార్చాయని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి 1).తక్కువ సంగమం వద్ద వ్యక్తిగత నియంత్రణ కణాలు మరియు kd కణాలు ఒకేలా కనిపించాయి (మూర్తి 1A, D).ఫ్యూజన్ తర్వాత 24 గంటల తర్వాత, నియంత్రణ కణాలు వాటి క్యూబాయిడల్ ఆకారాన్ని (Fig. 1B, E) నిలుపుకున్నాయి, అయితే SPECC1L-kd కణాలు పొడుగుగా ఉంటాయి (Fig. 1C, F).సెల్ ఆకృతిలో ఈ మార్పు యొక్క పరిధిని నియంత్రణ కణాలు మరియు kd కణాల వివో లైవ్ ఇమేజింగ్ ద్వారా సంగ్రహించబడింది (సినిమా 1).సంగమ కణాలలో SPECC1L పాత్రను నిర్ణయించడానికి, మేము మొదట దాని వ్యక్తీకరణను పరిశీలించాము.కలయికపై SPECC1L ప్రోటీన్ స్థాయిలు పెరిగాయని మేము కనుగొన్నాము (మూర్తి 1G), అయితే SPECC1L ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలు పెరగలేదు (మూర్తి 1H).అదనంగా, సెల్ సాంద్రత పెరిగినప్పుడు, SPECC1L ప్రోటీన్ ఇంటర్ సెల్యులార్ సరిహద్దుల వద్ద (Fig. 2A-E) పేరుకుపోయింది, పొర-సంబంధిత β-కాటెనిన్ (Fig. 2A'-E')తో ఒక నమూనా అతివ్యాప్తి చెందుతుంది.యాక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్ 18,23తో SPECC1L అనుబంధాన్ని బట్టి, SPECC1L యాక్టిన్-ఆధారిత అంటుకునే జంక్షన్‌లతో (AJ) సంకర్షణ చెందుతుందని మేము ఊహించాము.
(AF) SPECC1L నాక్‌డౌన్ (DF) సెల్‌లు నియంత్రణ U2OS సెల్‌లతో (AC) పోలిస్తే అధిక సంగమం (F) వద్ద పొడుగుగా ఉంటాయి.మేము వేర్వేరు సెల్ సాంద్రతల కోసం ఎంచుకున్న ఆరు టైమ్ పాయింట్‌లలో మూడు (T1, T3, T6) ఇక్కడ చూపబడింది.(G) నియంత్రణ కణాలలో తక్కువ స్థాయి సంగమంతో పోలిస్తే SPECC1L ప్రోటీన్ అధిక స్థాయి సంగమం వద్ద స్థిరీకరించబడిందని వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ చూపిస్తుంది.SPECC1L యొక్క వెస్ట్రన్ బ్లాట్ ఊహించిన 120 kDa బ్యాండ్ మరియు అధిక మాలిక్యులర్ వెయిట్ బ్యాండ్‌ను చూపుతుంది, బహుశా అనువదించబడిన తర్వాత సవరించబడింది (*).తక్కువ మరియు అధిక సంగమం కోసం అదే పరిస్థితులలో వెస్ట్రన్ బ్లాట్ విశ్లేషణ జరిగింది.తక్కువ మరియు అధిక సంగమం వద్ద SPECC1Lని చూపే చిత్రాలు అదే బ్లాట్ నుండి తీసుకోబడ్డాయి.అదే మచ్చ తొలగించబడింది మరియు β- ఆక్టిన్ యాంటీబాడీతో తిరిగి పరిశీలించబడింది.(H) పరిమాణాత్మక RT-PCR విశ్లేషణ SPECC1L ట్రాన్స్క్రిప్ట్ స్థాయిలలో గణనీయమైన మార్పులను చూపించలేదు.ఎర్రర్ బార్‌లు నాలుగు స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి SEMలను సూచిస్తాయి.
(AE) SPECC1L నాక్‌డౌన్ (kd)తో U2OS సెల్‌లలో సెల్ ఆకార విశ్లేషణ మరియు AJ మార్పులను సాధారణీకరించడానికి మేము సెల్ సాంద్రతల పరిధిని సూచించే ఆరు టైమ్ పాయింట్‌లను (T1-T6) ఎంచుకున్నాము.ఈ సమయ బిందువులలో మొదటి ఐదు సింగిల్ సెల్స్ (T1), 50-70% చిన్న సెల్ క్లస్టర్‌ల కలయిక (T2), kd కణాలను పునర్నిర్మించకుండా కలయిక (T3), kd కణాలను పునర్నిర్మించడం (T4) మరియు 24 గంటల మార్పులు ఉన్నాయి.kd (T5) కణాల వెనుక రూపంలో.SPECC1L ప్రోటీన్ ప్రధానంగా T1 (A) వద్ద సైటోప్లాజంలో చెదరగొట్టబడింది, అయితే దాని చేరడం తదుపరి సమయ బిందువులలో (B-E, బాణాలు) ఇంటర్ సెల్యులార్ సరిహద్దుల వద్ద గమనించబడింది.(FJ) β-కాటెనిన్ AJ కాంప్లెక్స్‌తో అనుబంధించబడిన ఇంటర్ సెల్యులార్ సరిహద్దుల వద్ద ఒకే విధమైన సంచితాన్ని చూపుతుంది.(A'-E') SPECC1L మరియు β-catenin అధిక సెల్ సాంద్రత (బాణాలు) వద్ద సెల్ సరిహద్దుల వద్ద అతివ్యాప్తి చెందుతున్న మరకలను చూపుతాయి.(F'-J') SPECC1L-kd కణాలలో, తక్కువ సెల్ సాంద్రత (F'-H') వద్ద β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్ సాధారణంగా కనిపిస్తుంది, కానీ సెల్ ఆకారం మారినప్పుడు (I', J'; బాణాలు) విస్తరిస్తుంది, ఇది AJ అని సూచిస్తుంది మారాయి.బార్లు = 10 µm.
మేము AJపై SPECC1L లోపం యొక్క ప్రభావాన్ని గుర్తించడానికి ప్రయత్నించాము.మేము అనేక AJ-అనుబంధ మార్కర్‌లను ఉపయోగించాము, వీటిలో కానానికల్ భాగాలు F-actin, myosin IIb, β-catenin మరియు E-cadherin24,25,26,27 ఉన్నాయి.గతంలో వివరించిన విధంగా SPECC1L-kd కణాలలో యాక్టిన్ ఒత్తిడి ఫైబర్‌లు పెరిగాయి (Fig. 3A,B) 18 .యాక్టిన్ ఫిలమెంట్స్‌తో అనుబంధించబడిన Myosin IIb విట్రోలోని SPECC1L-kd కణాలలో ఇదే విధమైన పెరుగుదలను చూపించింది (Fig. 3C,D).AJ-అనుబంధ β-కాటెనిన్ కణ త్వచం వద్ద క్యాథరిన్‌తో బంధిస్తుంది, నియంత్రణ క్యూబోసైట్‌లలో సాధారణ “తేనెగూడు” వ్యక్తీకరణ నమూనాను చూపుతుంది (Fig. 3E,G).ఆసక్తికరంగా, కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి ఫ్లాట్ ఇమేజ్‌లలో, β-కాటెనిన్ (Fig. 3E,F) మరియు E-క్యాథరిన్ (Fig. 3G,H) సంగమ SPECC1L-లోపం గల కణాల కణ త్వచంపై మరకలు పొడిగించబడిన స్టెయినింగ్ యొక్క ప్రముఖ నమూనాలను చూపించాయి.Kd కణాలలో AJ-అనుబంధ β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్ యొక్క ఈ విస్తరణ సంగమం వద్ద ఎక్కువగా కనిపిస్తుంది, కానీ సెల్ ఆకృతిలో మార్పులకు ముందు కనిపించింది (Fig. 2F-J, F'-J').ఈ విస్తరించిన AJ స్టెయినింగ్ యొక్క భౌతిక స్వభావాన్ని గుర్తించడానికి, మేము ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ (TEM) (Figure 3I, J) ద్వారా SPECC1L-kd U2OS కణాల ఎపికల్-బేసల్ ఉపరితలంపై సెల్ సరిహద్దులను పరిశీలించాము.AJ (బాణాలు) సూచించే ప్రత్యేక ఎలక్ట్రాన్ దట్టమైన ప్రాంతాలను కలిగి ఉన్న నియంత్రణ కణాలకు (Fig. 3I) విరుద్ధంగా, kd కణాలు (Fig. 3J) ఎపికోబాసల్ ప్లేన్‌తో పాటు AJ యొక్క అధిక ఎలక్ట్రాన్ సాంద్రతను సూచించే పెద్ద, సమీప ప్రాంతాలను చూపించాయి..అదనంగా, విలోమ విభాగాలలో, మేము kd కణాలలో (Fig. S1A,B) విస్తృతమైన కణ త్వచం మడతలను గమనించాము, ఇది β-కాటెనిన్ మరియు E-క్యాథరిన్ స్టెయినింగ్ బ్యాండ్‌ల (Fig. 3F,H) యొక్క విస్తరించిన నమూనాను వివరిస్తుంది.AJ లలో SPECC1L పాత్రకు మద్దతుగా, β-కాటెనిన్ SPECC1Lతో కలిసే U2OS కణాల లైసేట్‌లలో సహ-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయబడింది (Fig. 3K).AJ మార్కర్ల కోసం పొడిగించిన ఇమ్యునోస్టెయినింగ్‌తో పాటు, TEM విశ్లేషణ SPECC1L లోపం AJ ఎపికల్-బేసల్ డెన్సిటీ మరియు వైవిధ్యాన్ని పెంచుతుందనే మా పరికల్పనకు అనుగుణంగా ఉంది.
(AH) 48 గంటల పోస్ట్-ఫ్యూజన్ (T6; A, B) వద్ద kd కణాలలో F-ఆక్టిన్ స్టెయినింగ్ పెరిగింది.F-ఆక్టిన్ (C, D)తో అనుబంధించబడిన మైయోసిన్ IIb యొక్క మార్చబడిన మరక.నియంత్రణ కణాలలో (E, G) β-కాటెనిన్ మరియు E-క్యాథరిన్ మెమ్బ్రేన్ స్టెయినింగ్ యొక్క మృదువైన నమూనా SPECC1L-kd (F, H) కణాలలో మెరుగుపరచబడింది.బార్లు = 10 µm.(I-J) ఎపికల్-బేసల్ ఇంటర్ సెల్యులార్ జంక్షన్‌ను గమనిస్తున్న ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లు.నియంత్రణ కణాలు స్టిక్కీ జంక్షన్‌లను సూచించే ప్రత్యేక ఎలక్ట్రాన్-దట్టమైన ప్రాంతాలను చూపుతాయి (I, బాణాలు).దీనికి విరుద్ధంగా, SPECC1L-kd కణాలలో మొత్తం ఎపికల్-బేసల్ జంక్షన్ ఎలక్ట్రాన్ దట్టంగా (J, బాణాలు) కనిపించింది, ఇది పెరిగిన సాంద్రత మరియు అంటుకునే జంక్షన్‌ల వ్యాప్తిని సూచిస్తుంది.(K) β-కాటెనిన్ సంగమ U2OS సెల్ లైసేట్‌లలో SPECC1Lతో సహ-ఇమ్యునోప్రెసిపిటేట్ చేయబడింది.నాలుగు స్వతంత్ర ప్రయోగాలలో ఒకదానిని సూచించే ఒక ప్రదేశం నుండి తీసిన చిత్రం.
క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌లో SPECC1L పాత్రను అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము రెండు స్వతంత్ర ES ట్రాప్ సెల్ లైన్‌లను ఉపయోగించి Specc1l లోపం ఉన్న మౌస్ మోడల్‌ను సృష్టించాము, DTM096 మరియు RRH048 (BayGenomics, CA), ఇవి ఇంట్రాన్ 1 మరియు Specc1l ట్రాన్‌స్క్రిప్ట్‌లను సూచిస్తాయి (Fig.115 వద్ద సంగ్రహించబడింది) .4A, ఫిగర్ S2).డికోయ్ వెక్టర్ ఇన్సర్ట్ యొక్క జన్యు స్థానం మొత్తం జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ ద్వారా నిర్ణయించబడింది మరియు PCR (Fig. S2) ద్వారా నిర్ధారించబడింది.రెండు జీన్ ట్రాప్ డిజైన్‌లు కూడా సంగ్రహించిన తర్వాత Specc11-lacZ రిపోర్టర్‌ల ఇన్-ఫ్రేమ్ ఫ్యూజన్‌ను అనుమతించాయి.కాబట్టి, X-gal స్టెయినింగ్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన lacZ వ్యక్తీకరణ Specc11 వ్యక్తీకరణకు సూచికగా ఉపయోగించబడింది.రెండు యుగ్మ వికల్పాలు ఒకే విధమైన lacZ వ్యక్తీకరణ నమూనాలను చూపించాయి, ఇంట్రాన్ 1లోని DTM096 జీన్ ట్రాప్ ఇంట్రాన్ 15లోని RRH048 కంటే బలమైన వ్యక్తీకరణను చూపుతుంది (చూపబడలేదు).అయినప్పటికీ, Specc1l విస్తృతంగా వ్యక్తీకరించబడింది, ముఖ్యంగా E8.5 వద్ద నాడీ మడతలలో (Figure 4B), E9.5 మరియు E10.5 వద్ద నాడీ ట్యూబ్ మరియు ముఖ ప్రక్రియలలో (Figure 4C,D) మరియు అభివృద్ధి చెందుతున్న అవయవాలలో E10 వద్ద.5 మరియు కళ్ళు (మూర్తి 4D).E10.5 వద్ద మొదటి ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌లోని SPECC1L వ్యక్తీకరణ CNCC వంశానికి అనుగుణంగా ఎపిథీలియం మరియు అంతర్లీన మెసెన్‌చైమ్18లో ఉందని మేము గతంలో నివేదించాము.CNCCలో SPECC1L వ్యక్తీకరణను పరీక్షించడానికి, మేము E8.5 న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ (Figure 4E-J) మరియు E9.5 స్కల్ సెక్షన్‌లను (మూర్తి 4K-) ప్రదర్శించాము.E8.5 వద్ద, SPECC1L స్టెయిన్డ్ న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ తీవ్రంగా (Fig. 4E, H), NCC మార్కర్‌లతో (Fig. 4G, J) తడిసిన కణాలతో సహా.E9.5 వద్ద, SPECC1L (Fig. 4K, N) AP2A (Fig. 4L, M) లేదా SOX10 (Fig. 4O, P)తో కలిసి స్టెయిన్ చేయబడిన మైగ్రేటింగ్ CNCC బలంగా ఉంది.
(A) ES DTM096 (ఇంట్రాన్ 1) మరియు RRH048 (ఇంట్రాన్ 15) సెల్ క్లోన్‌లలో డికోయ్ వెక్టర్ ఇన్సర్షన్‌ను చూపుతున్న మౌస్ స్పెక్11 జన్యువు యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం.(BD) E8.5 నుండి E10.5 వరకు Specc1l వ్యక్తీకరణను సూచించే హెటెరోజైగస్ Specc1lDTM096 పిండాల lacZ స్టెయినింగ్.NE = న్యూరోఎక్టోడెర్మ్, NF = నాడీ మడత, PA1 = మొదటి ఫారింజియల్ ఆర్చ్.(EP) E8.5 (NF; EJ) న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ మరియు E9.5 (KP) పుర్రె విభాగాలలో NCC మార్కర్స్ AP2A మరియు SOX10తో SPECC1L ఇమ్యునోస్టెయినింగ్.AP2A (F, G; బాణం తలలు) మరియు SOX10 (I, J; బాణం తలలు)తో లేబుల్ చేయబడిన కణాలతో సహా, న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ E8.5 (E, H; బాణం తలలు)లో SPECC1L స్టెయినింగ్ విస్తృతంగా గమనించబడింది.E9.5 వద్ద, SPECC1L AP2A (L, M; బాణాలు) మరియు SOX10 (O, P; బాణాలు) లేబుల్ చేయబడిన మైగ్రేటింగ్ CNCC లు (K, N; బాణాలు) బలంగా తడిసినవి.
హెటెరోజైగస్ Specc1lDTM096/+ మరియు Specc1lRRH048/+ ఎలుకల మధ్య క్రాసింగ్ రెండు జీన్ ట్రాప్ యుగ్మ వికల్పాలు పరిపూరకరమైనవి కావు మరియు జన్యు ట్రాప్ యుగ్మ వికల్పం కోసం సమ్మేళనం హెటెరోజైగోట్‌లు మరియు ఎంబ్రియోనిక్ హోమోజైగోట్‌లు పిండ ప్రాణాంతకమైనవి (టేబుల్ S1).మెండెలియన్ నిష్పత్తులు పుట్టుకతో హెటెరోజైగోట్‌ల మనుగడ రేటులో తగ్గుదలని సూచించాయి (అంచనా 1.34 vs. 2.0).మేము హెటెరోజైగోట్లలో తక్కువ పెరినాటల్ మరణాలను గుర్తించాము, కొన్నింటికి క్రానియోఫేషియల్ క్రమరాహిత్యాలు ఉన్నాయి (Fig. S3).అయినప్పటికీ, ఈ పెరినాటల్ క్రానియోఫేషియల్ ఫినోటైప్‌ల యొక్క తక్కువ ప్రవేశం వాటి అంతర్లీన పాథోఫిజియోలాజికల్ మెకానిజమ్‌లను అధ్యయనం చేయడం కష్టతరం చేస్తుంది.అందువల్ల, మేము హోమోజైగస్ స్పెక్ 11 మార్పుచెందగలవారి పిండం ప్రాణాంతక సమలక్షణంపై దృష్టి సారించాము.
చాలా సమ్మేళనం హెటెరోజైగస్ లేదా హోమోజైగస్ Specc1lDTM096/RRH048 ఉత్పరివర్తన పిండాలు E9.5–10.5 (Fig. 5A-D) తర్వాత అభివృద్ధి చెందలేదు మరియు నాడీ ట్యూబ్ ముందు భాగంలో మూసివేయబడలేదు (Fig. 5B, D) మరియు కొన్నిసార్లు పృష్ఠంగా మూసివేయబడలేదు (చూపబడలేదు) ..ఈ కపాల నాడీ ట్యూబ్ మూసివేత లోపం E10.5 వద్ద ఉన్న న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లో మిగిలి ఉన్న CNCC మార్క్ DLX2తో సంబంధం కలిగి ఉంది, ఇది విచ్ఛేదం లేదని సూచిస్తుంది (మూర్తి 5A'-D').CNCC యొక్క మొత్తం పరిమాణం కూడా తగ్గించబడిందో లేదో తెలుసుకోవడానికి, మేము Wnt1-Cre మరియు ROSAmTmGతో మా జీన్ ట్రాప్ లైన్‌లలో GFPతో CNCC లైన్‌లను ట్యాగ్ చేసాము.మేము మొత్తం పిండాల నుండి క్రమబద్ధీకరించబడిన GFP+ NCC మరియు GFP- (RFP+) కాని NCCని ప్రసారం చేస్తాము.E9.5 వద్ద, ఫ్లో-సార్టెడ్ GFP-లేబుల్ చేయబడిన CNCCల నిష్పత్తి WT మరియు ఉత్పరివర్తన పిండాల మధ్య గణనీయంగా మారలేదు (చూపబడలేదు), ఇది సాధారణ CNCC స్పెసిఫికేషన్‌ను సూచిస్తుంది.అందువల్ల, బహిర్గతమైన న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లో (Figure 5B') అవశేష Wnt1-Cre మరియు DLX2 స్టెయినింగ్ అనేది లోపభూయిష్ట CNCC లేయరింగ్ వల్ల కావచ్చు, బహుశా SPECC1L-kd కణాలలో కనిపించే విధంగా పెరిగిన సాంద్రత లేదా AJ కణాల చెదరగొట్టడం వల్ల కావచ్చునని మేము ఊహించాము.న్యూరల్ ఫోల్డ్‌లో CNCC ఉనికిని నిర్ధారించడానికి మేము NCC గుర్తులను SOX10, AP2A మరియు DLX2 ఉపయోగించాము (మూర్తి 5E-R).E8.5 వద్ద, WT (Fig. 5E, G, I) మరియు Specc1l ఉత్పరివర్తన (Fig. 5F, H, J) విభాగాలలో మూడు NCC మార్కర్లకు నాడీ మడత మరకలు గమనించబడ్డాయి.E9.5 వద్ద, NCC మార్కర్లు WT విభాగాలలో (Fig. 5M, O, Q) మైగ్రేటింగ్ NCCకి మరకలను కలిగి ఉండగా, Specc1l ఉత్పరివర్తన పిండాల (Fig. 5N, P, R) యొక్క బహిర్గత నాడీ మడతలలో అవశేష NCC మరకలు గమనించబడ్డాయి.SOX10 మరియు DLX2 CNCCలను మైగ్రేటింగ్ చేస్తున్నందున, ఈ ఫలితం SPECC1L-లోపం ఉన్న CNCCలు పోస్ట్-మైగ్రేటరీ స్పెసిఫికేషన్‌ను సాధిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి కానీ నాడీ మడతల నుండి మైగ్రేట్ చేయడంలో విఫలమవుతాయి.
Specc11 లోపం లోపభూయిష్ట న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేతకు దారితీస్తుంది, కపాల నాడీ క్రెస్ట్ కణాలు మరియు AJల డీలామినేషన్.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A')తో లేబుల్ చేయబడిన మైగ్రేటింగ్ క్రానియల్ న్యూరల్ క్రెస్ట్ సెల్స్ (CNCC) మోస్తున్న పిండం.దీనికి విరుద్ధంగా, Specc11 ఉత్పరివర్తన పిండాలు ఓపెన్ న్యూరల్ ఫోల్డ్‌లు (B), బాణం తలలు) మరియు CNCCలు మారని (B', బాణం తలలు) చూపుతాయి.(C, D') బ్రైట్ ఫీల్డ్ ఇమేజ్‌లు (C, D') మరియు ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ (C', D') యొక్క CNCC మార్కర్ DLX2 యొక్క E10.5 WT పిండాలు (C, C') మరియు Specc1l (D, D').WT E10.5 పిండాలలో, DLX2-పాజిటివ్ CNCC గిల్ ఆర్చ్‌లను (C', బాణాలు) కాలనైజ్ చేస్తుంది, అయితే మార్పుచెందగలవారిలో, ఓపెన్ న్యూరల్ ఫోల్డ్‌లలో (D', బాణాలు) మరియు మొదటి ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌లలో (D',) స్పష్టమైన మరకలు కొనసాగుతాయి. బాణాలు).) CNCC యొక్క పేలవమైన డీలామినేషన్ మరియు మైగ్రేషన్‌ని సూచించే కొన్ని మరకలతో (బాణాలు).ER) E8.5 (E-L) మరియు E9.5 (M-R) దశల్లోని WT మరియు Specc1l ఉత్పరివర్తన పిండాల విభాగాలు NCC గుర్తులను SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H,)తో లేబుల్ చేయబడ్డాయి. O, P ) మరియు DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 వద్ద, వైల్డ్-టైప్ న్యూరల్ ఫోల్డ్ (NF) మరియు ఉత్పరివర్తన విభాగాలలో NCC స్టెయినింగ్ గమనించబడింది.E8.5 WT (K) మరియు ఉత్పరివర్తన (L)లో SOX10 మరియు β-కాటెనిన్ యొక్క సహ-రంగు నాడీ మడతలలో సెల్ సరిహద్దుల వద్ద పెరిగిన β-కాటెనిన్ మరకను వెల్లడించింది.E9.5 వద్ద, మైగ్రేటింగ్ CNCCల (M, O, Q) వైల్డ్-టైప్ స్టెయినింగ్ గమనించబడింది, అయితే మార్పుచెందగలవారిలో, అన్‌స్ట్రాటిఫైడ్ CNCCలు ఓపెన్ న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ (N, P, R) స్టెయిన్ చేయబడ్డాయి.(S-Z) E9.5 మ్యుటేషన్‌తో WT మరియు Specc11DTM096/RRH048 పిండాల యొక్క కరోనల్ విభాగాలలో వివో AJ లేబులింగ్ విశ్లేషణలో.ఎగువ కుడి మూలలో సుమారుగా సెక్షనల్ ప్లేన్ చూపబడింది.ఉత్పరివర్తన చెందిన కణజాల విభాగాలలో, F-ఆక్టిన్ (S, T) మరియు మైయోసిన్ IIb (U, V) యొక్క పెరిగిన మరకలు గమనించబడ్డాయి.అంజీర్ 3లోని ఇన్ విట్రో ఫలితాల మాదిరిగానే, ఉత్పరివర్తన చెందిన పిండాలలో, β-కాటెనిన్ (W, X) మరియు E-క్యాథరిన్ (Y, Z) కోసం మెరుగైన మెమ్బ్రేన్ స్టెయినింగ్ గమనించబడింది.(AA-BB) ఎపికల్-బేసల్ సెల్ సరిహద్దుకు ఆవల కనిపించే వైల్డ్-టైప్ పిండం యొక్క ఒక విభాగం యొక్క ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్ అంటుకునే జంక్షన్‌లను సూచించే ప్రత్యేక ఎలక్ట్రాన్-దట్టమైన ప్రాంతాన్ని చూపుతుంది (AA, బాణాలు).దీనికి విరుద్ధంగా, Specc11 ఉత్పరివర్తన పిండాల (BB, బాణాలు) విభాగాలలో, మొత్తం ఎపికోబాసల్ జంక్షన్ ఎలక్ట్రాన్ దట్టంగా ఉంటుంది, ఇది పెరిగిన సాంద్రత మరియు అంటుకునే జంక్షన్‌ల వ్యాప్తిని సూచిస్తుంది.
మార్చబడిన AJ కారణంగా పొరలు తగ్గాయని మా పరికల్పనను పరీక్షించడానికి, మేము Specc1l ఉత్పరివర్తన పిండాల (Fig. 5S-Z) యొక్క బహిర్గత నాడీ మడతలలో AJ లేబులింగ్‌ను పరిశీలించాము.మేము ఆక్టిన్ స్ట్రెస్ ఫైబర్స్ (Fig. 5S, T) పెరుగుదల మరియు ఆక్టిన్ ఫైబర్స్ (Fig. 5U, V) పై మైయోసిన్ IIB స్టెయినింగ్ యొక్క సారూప్య పెరిగిన స్థానికీకరణను గమనించాము.ముఖ్యముగా, ఇంటర్ సెల్యులార్ సరిహద్దుల వద్ద β-కాటెనిన్ (Fig. 5W,X) మరియు E-క్యాథరిన్ (Fig. 5Y,Z) యొక్క పెరిగిన మరకలను మేము గమనించాము.మేము E8.5 పిండాల (Fig. 5K, L) యొక్క న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లో NCC యొక్క β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్‌ను కూడా పరిశీలించాము.β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్ Specc1l మ్యూటాంట్ న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ (Fig. 5L మరియు K)లో బలంగా కనిపించింది, ఇది AJ మార్పులు ప్రారంభమయ్యాయని సూచిస్తున్నాయి.E9.5 పిండాల పుర్రె విభాగాల ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోగ్రాఫ్‌లలో, WT (Fig. 5AA, BB మరియు S1E-H)తో పోలిస్తే Specc1l ఉత్పరివర్తన పిండాలలో విస్తరించిన ఎలక్ట్రాన్-దట్టమైన మరకలను మేము మళ్లీ గమనించాము.కలిసి చూస్తే, ఈ ఫలితాలు SPECC1L-kd U2OS సెల్‌లలో మా ఇన్ విట్రో ఫలితాలకు మద్దతు ఇస్తాయి మరియు మా ఉత్పరివర్తన పిండాలలో సిఎన్‌సిసి స్తరీకరణకు ముందు అసహజ AJ స్టెయినింగ్ ఉందని సూచిస్తున్నాయి.
AKT కార్యాచరణ మరియు E-క్యాథరిన్ స్థిరత్వం మధ్య తెలిసిన వ్యతిరేక సంబంధాన్ని బట్టి, 17,28 మేము PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ ప్రమేయాన్ని ఊహించాము.అదనంగా, మేము E9.5-10.5 వద్ద ప్రాణాంతకం (<5%) నుండి తప్పించుకున్న మా ఉత్పరివర్తన పిండాలలో కొన్ని సబ్‌పిడెర్మల్ పొక్కులను గమనించాము మరియు బదులుగా E13.5 వద్ద స్థిరపడ్డాము (Fig. S3).సబ్‌పిడెర్మల్ వెసికిల్స్ PDGFRα12 ఆధారంగా తగ్గిన PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ యొక్క ముఖ్య లక్షణం.ఫాంటౌజో మరియు ఇతరులు.(2014) PdgfraPI3K/PI3K ఉత్పరివర్తన పిండాలలో PDGFRα-ఆధారిత PI3K యాక్టివేషన్ యొక్క అంతరాయం సబ్‌పిడెర్మల్ వెసికిల్స్, న్యూరల్ ట్యూబ్ డిఫెక్ట్‌లు మరియు చీలిక అంగిలి ఫినోటైప్‌లకు దారితీస్తుందని నివేదించింది.నిజానికి, పాన్-ఎకెటి మరియు యాక్టివ్ ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ సెర్473-ఎకెటి స్థాయిలు స్పెక్1ఎల్ మ్యూటాంట్ టిష్యూలలో వివోలో ఇ9.5 ఎంబ్రియోనిక్ అరెస్ట్‌కి తగ్గించబడ్డాయి (Fig. 6A-D).ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ Ser473-AKT స్థాయిలలో తగ్గుదల పూర్తిగా vivo (FIG. 6E) మరియు ఇన్ విట్రో (FIG. 6F)లో పాన్-AKT స్థాయిలు తగ్గడం వల్ల కావచ్చు.U2OS కణాలు సెల్ ఆకారం మరియు AJ సాంద్రతలో మార్పులతో బలంగా కలిసినప్పుడు మాత్రమే ఇన్ విట్రో తగ్గుదల గమనించబడింది (మూర్తి 6D).అందువల్ల, క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌లో SPECC1L PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ యొక్క నవల సానుకూల నియంత్రకం అని మా డేటా సూచిస్తుంది.
(A-E) E8.5 (A,B) మరియు E9.5 (C,D) పుర్రె విభాగాలు లేదా Specc1l ఉత్పరివర్తన పిండాల (E) నుండి E9.5 లైసేట్లు క్రియాశీల ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ S473-AKT మరియు పాన్-AKT ప్రోటీన్ తగ్గింపు స్థాయిలను చూపుతున్నాయి , నియంత్రణ WTతో పోలిస్తే.అదే పరిస్థితులలో వైల్డ్-టైప్ లైసేట్‌లు మరియు మ్యూటాంట్ లైసేట్‌లపై వెస్ట్రన్ బ్లాటింగ్ నిర్వహించబడింది.SPECC1L కోసం చూపబడిన చిత్రాలు ఒక బ్లాట్ నుండి తీసుకోబడ్డాయి.అదే బ్లాట్ తొలగించబడింది మరియు యాంటీ-పాన్-ACT మరియు β-ఆక్టిన్ యాంటీబాడీస్‌తో తిరిగి పరీక్షించబడింది.E8.5 న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ (A, B)లో పాన్-AKT స్థాయిలు మరియు E9.5 పుర్రె విభాగాలలో ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ S473-AKT స్థాయిలు గణనీయంగా తగ్గాయి.(F) అధిక సంగమం వద్ద పండించిన SPECC1L-kd U2OS కణాల లైసేట్లలో కూడా పాన్-ఎకెటి స్థాయిలు తగ్గించబడ్డాయి.ఎర్రర్ బార్‌లు మూడు స్వతంత్ర వెస్ట్రన్ బ్లాట్ పరిమాణాల నుండి SEMలను సూచిస్తాయి.(GJ) E9.5 వద్ద ఉన్న WT పిండాల విభాగాలు వరుసగా KI67 మరియు క్లీవ్డ్ కాస్‌పేస్ 3తో తడిసినవి, కణాల విస్తరణ (G, G') మరియు తక్కువ అపోప్టోటిక్ కార్యాచరణ (H, H') చూపుతున్నాయి.Specc11 ఉత్పరివర్తన పిండాలు పోల్చదగిన కణాల విస్తరణ (I)ను చూపుతాయి, అయితే అపోప్టోసిస్‌కు గురైన కణాల సంఖ్య గణనీయంగా పెరిగింది (J).
మేము విస్తరణ మరియు అపోప్టోసిస్ యొక్క గుర్తులను పరిశీలించాము.WT మార్పుచెందగలవారికి 82.5% విస్తరణ సూచిక మరియు KI67 స్టెయినింగ్ (p <0.56, ఫిషర్స్) ద్వారా కొలవబడిన Specc1l మార్పుచెందగలవారికి 86.5% విస్తరణ సూచికతో E9.5 పిండాల విస్తరణ (Fig. 6E, G Iతో పోలిస్తే)లో మేము ఎటువంటి తేడాను గమనించలేదు. ఖచ్చితమైన పరీక్ష).అదేవిధంగా, పిండం అరెస్ట్ (చూపబడలేదు) (చూపబడలేదు) వరకు E8.5 వద్ద న్యూరల్ ఫోల్డ్స్‌లో క్లీవ్డ్ కాస్‌పేస్ 3 కోసం మరకలు వేయడం ద్వారా కొలవబడిన అపోప్టోసిస్‌లో ఎటువంటి తేడాను మేము గమనించలేదు.దీనికి విరుద్ధంగా, అన్ని E9.5 ఉత్పరివర్తన పిండాలలో అపోప్టోసిస్ గణనీయంగా పెరిగింది (Fig. 6F, H మరియు J).అపోప్టోసిస్‌లో ఈ మొత్తం పెరుగుదల తగ్గిన PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ మరియు ప్రారంభ పిండం ప్రాణాంతకం29,30,31కి అనుగుణంగా ఉంటుంది.
తరువాత, మా kd కణాలలో AJ మార్పులలో PI3K-AKT సిగ్నలింగ్‌కు కారణ పాత్రను నిర్ధారించడానికి, మేము నియంత్రణ మరియు kd కణాలలో మార్గాన్ని రసాయనికంగా మార్చాము (మూర్తి 7A-F).మేము సంగమ SPECC1L-kd కణాలలో గమనించిన సెల్ ఆకార మార్పు ఫినోటైప్‌ను మార్కర్‌గా ఉపయోగించాము, సంబంధిత నిలువు పరిమాణం (వెడల్పు)కి పొడవైన పరిమాణం (పొడవు) నిష్పత్తిని ఉపయోగించి మేము లెక్కించాము.సాపేక్షంగా రౌండ్ లేదా క్యూబాయిడల్ సెల్స్ కోసం 1 నిష్పత్తి అంచనా వేయబడుతుంది (మూర్తి 7G).సెల్ ఆకృతితో పాటు, మేము β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్ (Fig. 7A'-F') ద్వారా AJపై ప్రభావాన్ని కూడా నిర్ధారించాము.నియంత్రణ కణాలలో సెల్ ఆకారాన్ని మార్చడానికి (Figure 7A,C) మరియు AJ (Figure 7A') వోర్ట్‌మన్నిన్ ఉపయోగించి PI3K-AKT మార్గం యొక్క నిరోధం సరిపోతుంది.PI3K-AKT యాక్టివేటర్ SC-79 నియంత్రణ కణాలలో సెల్ ఆకారాన్ని (FIG. 7A, E) లేదా AJ విస్తరణ (FIG. 7A') ప్రభావితం చేయలేదు.SPECC1L-kd కణాలలో, PI3K-AKT మార్గం యొక్క మరింత అణచివేత ఫలితంగా అపోప్టోసిస్ (Fig. 7B,D) పెరిగింది మరియు β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్ (Fig. 7B')లో గణనీయమైన పెరుగుదల ఏర్పడింది, ఇది మా ఇన్ వివో హెవీ మ్యూటాంట్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.ముఖ్యముగా, PI3K-AKT పాత్వే యొక్క క్రియాశీలత సెల్ ఆకారాన్ని గణనీయంగా మెరుగుపరిచింది (మూర్తి 7B,F) మరియు AJ సమలక్షణాలు (మూర్తి 7B").సెల్ ఆకృతిలో మార్పులు సెల్ రౌండ్‌నెస్ రేషియో (CCR)గా లెక్కించబడ్డాయి మరియు పైన వివరించిన విధంగా ప్రాముఖ్యత కోసం పోల్చబడ్డాయి (FIG. 7G).నిజానికి, నియంత్రణ కణాలలో (Fig. 7G, CCR = 1.56), గమనించిన దానితో సమానంగా సెల్ ఆకారాన్ని (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) గణనీయంగా మార్చడానికి వోర్ట్‌మన్నిన్ చికిత్స సరిపోతుంది. SPECC1Lలో.-kd కణాలు (Fig. 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd కణాల వోర్ట్‌మన్నిన్ చికిత్స (Fig. 7G, CCR = 3.60, అతితక్కువ) చికిత్స చేయని kd కణాలు (Fig. 7G, CCR = 3.46, అతితక్కువ) లేదా వోర్ట్‌మన్నిన్-చికిత్స చేయబడిన నియంత్రణ కణాలు (Fig. 7G) కంటే ముఖ్యమైనది కాదు., CCR = 3.46, అతితక్కువ) అదనంగా సెల్ పొడుగును ప్రభావితం చేస్తుంది (7G, CCR = 3.61, అతితక్కువ).మరీ ముఖ్యంగా, SC-79 AKT యాక్టివేటర్ SPECC1L-kd కణాల పొడుగుచేసిన సమలక్షణాన్ని పునరుద్ధరించింది (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).ఈ ఫలితాలు SPECC1L PI3K-AKT సిగ్నలింగ్‌ని నియంత్రిస్తుందని మరియు SPECC1Lలో మితమైన తగ్గుదల కణ సంశ్లేషణను ప్రభావితం చేస్తుందని నిర్ధారిస్తుంది, అయితే బలమైన తగ్గుదల అపోప్టోసిస్‌కు దారి తీస్తుంది (Fig. 8).
(A-F') నియంత్రణ (A, C, E) మరియు SPECC1L-kd (B, D, F) కణాలు PI3K-AKT పాత్‌వే ఇన్హిబిటర్ వోర్ట్‌మన్నిన్ (C, D) లేదా SC-79 యాక్టివేటర్ (E, F) చికిత్సతో చికిత్స చేయబడ్డాయి .చికిత్స చేయని నియంత్రణ కణాలు సాధారణ β-క్యాట్ సెల్యులార్ స్టెయినింగ్ (A')తో క్యూబాయిడల్ (A)గా ఉంటాయి, అయితే kd కణాలు పొడుగుగా ఉంటాయి (B) పెరిగిన β-క్యాట్ స్టెయినింగ్ (B').PI3K-AKT మార్గాన్ని అణిచివేసిన తర్వాత, β-క్యాట్ విస్తరణ (C')తో పొడుగుచేసిన (C) కణాలను నియంత్రిస్తాయి, అయితే kd కణాలు మన అత్యంత పరివర్తన చెందిన పిండాల మాదిరిగానే అపోప్టోసిస్ (D) చేయించుకోవడం ప్రారంభించాయి మరియు చాలా మెరుగైన β- పిల్లిని చూపుతాయి.మరక (D').PI3K-AKT మార్గం సక్రియం అయిన తర్వాత, నియంత్రణ కణాలు క్యూబాయిడల్ (E) మరియు సాధారణ β-పిల్లి (E') మరకను కలిగి ఉంటాయి, అయితే kd కణాలు గణనీయంగా మెరుగైన సెల్ ఆకారం (F) మరియు β-పిల్లి (F') స్టెయినింగ్‌ను చూపించాయి. (G) MetaMorph సాఫ్ట్‌వేర్‌ని ఉపయోగించి పొడవైన పరిమాణం (పొడవు) యొక్క సెల్ రౌండ్‌నెస్ రేషియో (CCR) మరియు సంబంధిత నిలువు పరిమాణం (వెడల్పు) ఉపయోగించి (AF)లో సెల్ ఆకార మార్పు యొక్క డిగ్రీ లెక్కించబడుతుంది.చికిత్స చేయని (NT) SPECC1L-kd కణాలు (CCR = 3.46) నియంత్రణ కణాల కంటే గణనీయంగా పొడవుగా ఉన్నాయి (CCR = 1.56, p <6.1 × 10–13).నియంత్రణ కణాలలో PI3K-AKT పాత్వే యొక్క వోర్ట్ యొక్క నిరోధం సెల్ ఆకారంలో (CCR=3.61, p<2.4×10-9) ఒకే విధమైన పొడిగింపును కలిగించడానికి సరిపోతుంది.అదేవిధంగా, SPECC1L-kd కణాలలో SC-79 ద్వారా AKT యాక్టివేషన్ నియంత్రణ స్థాయిలకు సెల్ పొడుగును పునరుద్ధరించింది (CCR = 1.74, p <6.2 × 10–12).SPECC1L-kd కణాల యొక్క వోర్ట్‌మన్నిన్ చికిత్స వలన అపోప్టోసిస్ పెరిగింది కానీ చికిత్స చేయని kd (CCR=3.46, ns) లేదా వోర్ట్‌మన్నిన్-చికిత్స నియంత్రణ కణాలు (3.61)తో పోలిస్తే సెల్ ఆకార మార్పులో (CCR=3.60) తదుపరి పెరుగుదల లేదు.ns = పట్టింపు లేదు.+/- 50 సెల్‌ల కోసం SEM కొలతలు చూపబడ్డాయి.స్టూడెంట్స్ టి-టెస్ట్ ఉపయోగించి గణాంక వ్యత్యాసాలు లెక్కించబడ్డాయి.
(A) PI3K-AKT మార్గం యొక్క నిరోధం మరియు క్రియాశీలత యొక్క స్కీమాటిక్ ప్రాతినిధ్యం వరుసగా AJ మార్పులు మరియు రెస్క్యూకి దారి తీస్తుంది.(B) SPECC1L ద్వారా AKT ప్రోటీన్ స్థిరీకరణ కోసం ప్రతిపాదిత నమూనా.
ప్రీమిగ్రేటరీ CNCCలకు పూర్వ నాడీ మడత న్యూరోపీథెలియల్ కణాలు1,15,32 నుండి వేరుచేయడానికి AJ లైసిస్ అవసరం.AJ భాగాల మరకలు పెరగడం మరియు SPECC1L-లోపభూయిష్ట కణాలలో SPECC1L-లోపభూయిష్ట కణాలలో AJ అసమాన పంపిణీని కోల్పోవడం, SPECC1L β-కాటెనిన్‌కు భౌతిక సామీప్యతతో కలిపి, AJ స్థానిక స్థిరత్వాన్ని సరిగ్గా నిర్వహించడానికి SPECC1L పని చేస్తుందని సూచిస్తున్నాయి. సంస్థ కండరాలు.యాక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్.యాక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్ మరియు β-కాటెనిన్‌తో SPECC1L యొక్క అనుబంధం మరియు SPECC1L లేనప్పుడు ఘనీభవించిన ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ సంఖ్య పెరుగుదల AJ సాంద్రతలో గమనించిన పెరుగుదలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది.మరొక అవకాశం ఏమిటంటే, SPECC1L-లోపం గల కణాలలో ఆక్టిన్ ఫైబర్‌ల సంఖ్య పెరగడం అనేది ఇంటర్ సెల్యులార్ టెన్షన్‌లో మార్పుకు దారితీస్తుంది.సెల్యులార్ ఒత్తిడి AJ 33 డైనమిక్స్‌ను ప్రభావితం చేస్తుంది కాబట్టి, వోల్టేజ్ మార్పులు మరింత వ్యాప్తి చెందుతాయి AJ 34 .కాబట్టి ఏవైనా మార్పులు CNCC లేయర్‌లను ప్రభావితం చేస్తాయి.
Wnt1 నాడీ క్రెస్ట్ కణాలకు దారితీసే ప్రారంభ నాడీ మడతలలో వ్యక్తీకరించబడింది.ఈ విధంగా, Wnt1-cre వంశ జాడలు NCC35కి ముందు మరియు మైగ్రేటింగ్ రెండింటినీ సూచిస్తాయి.అయినప్పటికీ, Wnt1 ప్రారంభ నాడీ మడతలు 35,36 నుండి తీసుకోబడిన డోర్సల్ మెదడు కణజాల క్లోన్‌లను కూడా సూచిస్తుంది, తద్వారా ఓపెన్ న్యూరల్ ఫోల్డ్‌లలో Wnt1 మార్కర్ల కోసం E9.5 మార్పుచెందగలవారు CNCC కాదు.NCC మార్కర్స్ AP2A మరియు SOX10 కోసం మా పాజిటివ్ స్టెయినింగ్ Specc11 ఉత్పరివర్తన పిండాల యొక్క బహిర్గత నాడీ మడతలు వాస్తవానికి CNCCని కలిగి ఉన్నాయని నిర్ధారించాయి.అదనంగా, AP2A మరియు SOX10 ప్రారంభ వలస NCC యొక్క గుర్తులు కాబట్టి, సానుకూల మరక ఈ కణాలు పోస్ట్-మైగ్రేటరీ CNCC అని సూచించింది, ఇవి E9.5 ద్వారా వర్గీకరించబడవు.
SPECC1L ద్వారా AJ యొక్క పరమాణు నియంత్రణ PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ ద్వారా మధ్యవర్తిత్వం చేయబడుతుందని మా డేటా సూచిస్తుంది.SPECC1L లోపం ఉన్న కణాలు మరియు కణజాలాలలో AKT సిగ్నలింగ్ తగ్గించబడింది.Fantauzzo మరియు ఇతరుల ద్వారా కనుగొన్నవి.క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌లో PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ కోసం ప్రత్యక్ష పాత్రకు మద్దతు ఇస్తుంది.(2014) PDGFRα- ఆధారిత PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ యొక్క క్రియాశీలత లేకపోవడం చీలిక అంగిలి సమలక్షణానికి దారితీస్తుందని చూపించింది.U2OS సెల్‌లలో AJ మరియు సెల్ ఆకారాన్ని మార్చడానికి PI3K-AKT మార్గం యొక్క నిరోధం సరిపోతుందని కూడా మేము చూపుతాము.మా పరిశోధనలకు అనుగుణంగా, కైన్ మరియు ఇతరులు.37 ఎండోథెలియల్ కణాలలో PI3K α110 సబ్‌యూనిట్‌ని తగ్గించడం వల్ల పెరిసెల్యులర్ β-కాటెనిన్ స్టెయినింగ్‌లో అదే విధమైన పెరుగుదల ఏర్పడుతుందని, దీనిని "కనెక్టివిటీ ఇండెక్స్"లో పెరుగుదలగా సూచిస్తారు.అయినప్పటికీ, ఎండోథెలియల్ కణాలలో యాక్టిన్ ఫిలమెంట్‌లు ఇప్పటికే బాగా వ్యవస్థీకృతమై ఉన్నాయి, PI3K-AKT మార్గం యొక్క అణచివేత వలన వదులుగా ఉండే సెల్ ఆకారం ఏర్పడుతుంది.దీనికి విరుద్ధంగా, SPECC1L-kd U2OS కణాలు పొడుగుచేసిన సెల్ ఆకారాన్ని చూపించాయి.ఈ వ్యత్యాసం సెల్ రకం నిర్దిష్టంగా ఉండవచ్చు.PI3K-AKT సిగ్నలింగ్ యొక్క అణచివేత యాక్టిన్ సైటోస్కెలిటన్‌ను శాశ్వతంగా ప్రభావితం చేస్తుంది, సెంట్రల్ ఆక్టిన్ ఫైబర్‌ల సాంద్రత మరియు సంస్థలో మార్పుల వల్ల ఏర్పడే ఉద్రిక్తతలో మార్పుల ద్వారా సెల్ ఆకారంపై ప్రభావం నిర్ణయించబడుతుంది.U2OS సెల్‌లలో, మేము SPECC1L-లోపం ఉన్న AJ మార్పు మరియు పునరుద్ధరణ యొక్క మార్కర్‌గా సెల్ ఆకార మార్పులను మాత్రమే ఉపయోగించాము.ముగింపులో, SPECC1L లోపంలో AKT మార్గం యొక్క నిరోధం AJ స్థిరత్వాన్ని పెంచుతుందని మరియు CNCCలో డీలామినేషన్‌ను తగ్గిస్తుందని మేము ఊహిస్తున్నాము.
ఆసక్తికరంగా, SPECC1L లేనప్పుడు ఫాస్ఫోరైలేటెడ్ 473-AKT స్థాయిలకు అదనంగా విట్రో మరియు వివోలో పాన్-AKT స్థాయిలు తగ్గించబడ్డాయి, AKT ప్రోటీన్ స్థిరత్వం లేదా టర్నోవర్ స్థాయిలో PI3K-AKT సిగ్నలింగ్‌ని నియంత్రించాలని సూచిస్తున్నాయి.Opitz/GBBB సిండ్రోమ్‌తో అనుబంధించబడిన SPECC1L మరియు MID1 జన్యువులు మైక్రోటూబ్యూల్స్ 18,22 స్థిరీకరించే ప్రోటీన్‌లను ఎన్‌కోడ్ చేస్తాయి.SPECC1L మరియు MID1 మైక్రోటూబ్యూల్ స్థిరీకరణను మధ్యవర్తిత్వం చేసే విధానం పూర్తిగా అర్థం కాలేదు.SPECC1L విషయంలో, ఈ స్థిరీకరణ మైక్రోటూబ్యూల్స్ 18 యొక్క ఉపసమితి యొక్క మెరుగైన ఎసిటైలేషన్‌ను కలిగి ఉంటుంది.AKT వంటి ఇతర ప్రోటీన్‌లను స్థిరీకరించడానికి SPECC1L ఇదే విధమైన యంత్రాంగాన్ని ఉపయోగించే అవకాశం ఉంది.AKT ప్రోటీన్‌లోని లైసిన్ అవశేషాల ఎసిటైలేషన్ మెమ్బ్రేన్ స్థానికీకరణ మరియు ఫాస్ఫోరైలేషన్‌లో తగ్గుదలకు దారితీస్తుందని తేలింది.అదనంగా, AKTపై అదే లైసిన్ అవశేషాల వద్ద K63 గొలుసు యొక్క సర్వవ్యాప్తి దాని పొర స్థానికీకరణ మరియు క్రియాశీలత39,40 కోసం అవసరం.వివిధ హై త్రూపుట్ ఈస్ట్ టూ-హైబ్రిడ్ స్క్రీన్‌లలో గుర్తించబడిన SPECC1L ప్రోటీన్‌లతో పరస్పర చర్య చేసే అనేక కారకాలలో, నాలుగు - CCDC841, ECM2942, APC మరియు UBE2I43 - సర్వవ్యాప్తి లేదా సుమోయిలేషన్ ద్వారా ప్రోటీన్ టర్నోవర్ లేదా స్థిరత్వంలో చిక్కుకున్నాయి.SPECC1L AKT లైసిన్ అవశేషాల యొక్క పోస్ట్-ట్రాన్స్‌లేషనల్ సవరణలో పాల్గొనవచ్చు, ఇది AKT స్థిరత్వాన్ని ప్రభావితం చేస్తుంది.అయినప్పటికీ, AKT ప్రోటీన్ యొక్క స్థానికీకరణ మరియు స్థిరత్వంలో SPECC1L యొక్క కీలక పాత్ర ఇంకా స్పష్టంగా చెప్పవలసి ఉంది.
వివోలో SPECC1L వ్యక్తీకరణలో తీవ్రమైన లోపాల ఫలితంగా AJ మార్కర్ స్టెయినింగ్ మరియు లోపభూయిష్ట CNCC ఓవర్‌లే పెరిగింది, అలాగే అపోప్టోసిస్ మరియు ప్రారంభ పిండం ప్రాణాంతకత పెరిగింది.అపోప్టోసిస్ స్థాయిలు పెరిగిన మౌస్ మార్పుచెందగలవారు న్యూరల్ ట్యూబ్ లోపాలు 44,45,46,47 మరియు క్రానియోఫేషియల్ లోపాలు48తో సంబంధం కలిగి ఉన్నారని మునుపటి నివేదికలు చూపించాయి.న్యూరల్ ఫోల్డ్స్ లేదా ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌లలో అధిక కణాల మరణం సరైన మోర్ఫోజెనెటిక్ కదలిక 48,49,50 కోసం అవసరమైన కణాల సంఖ్యకు దారితీయవచ్చని సూచించబడింది.దీనికి విరుద్ధంగా, మధ్యస్తంగా తగ్గించబడిన SPECC1L వ్యక్తీకరణతో మా SPECC1L లోపం ఉన్న సెల్ లైన్‌లు పెరిగిన సెల్ డెత్‌కు ఆధారాలు లేకుండా AJ మార్పులను మాత్రమే చూపించాయి.అయినప్పటికీ, ఈ Kd కణాలలో PI3K-AKT పాత్వే యొక్క రసాయన నిరోధం ఫలితంగా అపోప్టోసిస్ పెరిగింది.అందువలన, SPECC1L వ్యక్తీకరణ లేదా ఫంక్షన్‌లో మితమైన తగ్గుదల సెల్ మనుగడను నిర్ధారిస్తుంది.ఇది సెయింట్ వద్ద అరెస్టు నుండి తప్పించుకునే అరుదైన Specc11 ఉత్పరివర్తన పిండాలను గమనించడానికి అనుగుణంగా ఉంటుందిE9.5-బహుశా తగ్గిన జీన్ క్యాప్చర్ సామర్థ్యం కారణంగా-వాటి నాడీ గొట్టాలను మూసివేసి, అభివృద్ధిలో తర్వాత ఆగిపోతుంది, తరచుగా క్రానియోఫేషియల్ లోపాలతో (Fig. S3).క్రానియోఫేషియల్ అసాధారణతలతో కూడిన హెటెరోజైగస్ స్పెక్1ఎల్ పిండాల అరుదైన సంఘటన కూడా దీనికి అనుగుణంగా ఉంటుంది-బహుశా పెరిగిన జన్యు సంగ్రహ సామర్థ్యం కారణంగా-అలాగే జీబ్రాఫిష్‌లో కనుగొనడం, దీనిలో రెండు SPECC1L ఆర్థోలాగ్‌లలో ఒకటి (specc1lb) ఆలస్యంగా పిండ నష్టంతో సహా దిగువ దవడలు మరియు ద్వైపాక్షిక చీలికలు51.అందువల్ల, మానవ రోగులలో గుర్తించబడిన హెటెరోజైగస్ SPECC1L లాస్-ఆఫ్-ఫంక్షన్ ఉత్పరివర్తనలు క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్ సమయంలో SPECC1L ఫంక్షన్‌లో చిన్న బలహీనతలను కలిగిస్తాయి, ఇది వారి ఒరోఫేషియల్ చీలికలను వివరించడానికి సరిపోతుంది.SPECC1L-ఆధారిత ఇంటర్ సెల్యులార్ పరిచయాల నియంత్రణ కూడా పాలాటోజెనిసిస్ మరియు ఫారింజియల్ ఆర్చ్‌ల కలయికలో పాత్ర పోషిస్తుంది.SPECC1L ఫంక్షన్ యొక్క తదుపరి అధ్యయనాలు న్యూరోపీథెలియల్ సెల్ మోటిలిటీ మరియు క్రానియోఫేషియల్ మోర్ఫోజెనిసిస్‌లో న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేత సమయంలో CNCCలో తాత్కాలిక ఇంటర్ సెల్యులార్ పరిచయాల పాత్రను వివరించడంలో సహాయపడతాయి.
U2OS ఆస్టియోసార్కోమా నియంత్రణ మరియు SPECC1L-kd కణాలు గతంలో వివరించబడ్డాయి (సాదీ మరియు ఇతరులు, 2011).SPECC1Lకి వ్యతిరేకంగా ప్రతిరోధకాలు గతంలో కూడా వర్గీకరించబడ్డాయి (సాదీ మరియు ఇతరులు, 2011).యాంటీ-β-కాటెనిన్ యాంటీబాడీస్ (కుందేలు; 1:1000; శాంటా క్రజ్, డల్లాస్, TX) (మౌస్; 1:1000; సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ, డాన్వర్స్, MA), మైయోసిన్ IIb (1:1000; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్ ) , MO) ), ఇ-క్యాథరిన్ (1:1000; అబ్కామ్, కేంబ్రిడ్జ్, MA), AP2A (1:1000; నోవస్ బయోలాజికల్స్, లిటిల్టన్, కోలో.), SOX10 (1:1000; 1000; అవివా సిస్టమ్స్ బయాలజీ, శాన్ డియాగో , కాలిఫోర్నియా), DLX2 (1:1000; Abcam, కేంబ్రిడ్జ్, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ, డాన్వర్స్, MA), పాన్-AKT (1:1000; ThermoFisher సైంటిఫిక్, వాల్థమ్ ) , KI67 (1:1000; సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ, డాన్వర్స్, MA), క్లీవ్డ్ కాస్పేస్ 3 (1:1000; సెల్ సిగ్నలింగ్ టెక్నాలజీ, డాన్వర్స్, MA) మరియు β-ఆక్టిన్ (1:2500; సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్. MO) వివరించిన విధంగా ఉపయోగించబడింది..ఆక్టిన్ ఫిలమెంట్స్ యాక్టి-స్టెయిన్ రోడమైన్ ఫాలోయిడిన్ (సైటోస్కెలిటన్, డెన్వర్, కొలరాడో)తో తడిసినవి.
U2OS నియంత్రణ కణాలు మరియు SPECC1L-kd కణాలు 10% పిండం బోవిన్ సీరం (లైఫ్ టెక్నాలజీస్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA)తో అనుబంధంగా ఉన్న అధిక గ్లూకోజ్ DMEMలో కల్చర్ చేయబడ్డాయి.AJ మార్పుల కోసం, 2 x 105 కణాలు 0.1% పోర్సిన్ జెలటిన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO)తో చికిత్స చేయబడిన గాజుపై సీడ్ చేయబడ్డాయి మరియు సెల్ ఆకృతిలో మార్పుల కోసం గమనించబడ్డాయి.వేర్వేరు సూచించిన సమయ బిందువులలో కణాలు సేకరించబడ్డాయి: విత్తనాలు వేసిన 4 గంటలు (t = 1), విత్తిన 24 గంటలు (t = 2), సెల్ ఆకారంలో మార్పు లేకుండా సంగమం (t = 3), సెల్ ఆకారంలో మార్పు (t = 4) , సెల్ ఆకారాన్ని మార్చిన తర్వాత 24 గం (t = 5) మరియు సెల్ ఆకారాన్ని మార్చిన తర్వాత 48 గం (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).PI3K-AKT మార్గాన్ని మాడ్యులేట్ చేయడానికి, PI3K-AKT ఇన్హిబిటర్ వోర్ట్‌మన్నిన్ (TOCRIS బయోసైన్సెస్, మిన్నియాపాలిస్, మిన్నెసోటా) లేదా SC-79 యాక్టివేటర్ (TOCRIS బయోసైన్సెస్, మిన్నియాపాలిస్ ఆడమ్స్)తో సూచించిన సాంద్రతలలో కణాలు కల్చర్ చేయబడ్డాయి.రసాయనాలను కలిగి ఉన్న మాధ్యమం ప్రతిరోజూ మార్చబడింది.
సాధారణ సంస్కృతి పరిస్థితులలో లైవ్ కంట్రోల్ మరియు KD సెల్‌లపై ఫ్రేమ్-బై-ఫ్రేమ్ రికార్డింగ్‌లు చేయబడ్డాయి మరియు ప్రతి 10 నిమిషాలకు 7 రోజుల పాటు దశ కాంట్రాస్ట్ చిత్రాలు సేకరించబడతాయి.మెకానికల్ స్టేజ్‌తో కూడిన కంప్యూటర్-నియంత్రిత లైకా DM IRB ఇన్‌వర్టెడ్ మైక్రోస్కోప్ మరియు QImaging Retiga-SRV కెమెరాకు కనెక్ట్ చేయబడిన 10 × N-PLAN లక్ష్యం ఉపయోగించి చిత్రాలు పొందబడ్డాయి.ఇమేజింగ్ సమయంలో, సెల్ కల్చర్‌లు 5% CO2తో తేమతో కూడిన వాతావరణంలో 37 ° C వద్ద నిర్వహించబడతాయి.
ప్రాంతీయ ఉత్పరివర్తన మౌస్ రిసోర్స్ సెంటర్ (UC డేవిస్, CA) నుండి రెండు జీన్ ట్రాప్ ES సెల్ లైన్‌లు DTM096 మరియు RRH048 Specc11 లోపం ఉన్న మౌస్ లైన్‌లను రూపొందించడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి, నియమించబడిన Specc1lgtDTM096 మరియు Specc1lgtRRH046.క్లుప్తంగా, 129/REJ ES కణాలు C57BL6 బ్లాస్టోసిస్ట్‌లలోకి ఇంజెక్ట్ చేయబడ్డాయి.ఫలితంగా వచ్చిన చిమెరిక్ మగ ఎలుకలను ఆడ C57BL6 ఎలుకలతో సంతానాన్ని అగౌటి కోట్ కలర్‌తో గుర్తించడానికి పెంచారు.హెటెరోజైగోట్‌లను గుర్తించడానికి జీన్ ట్రాప్ వెక్టర్ ఇన్‌సర్ట్‌ల ఉనికిని ఉపయోగించారు.ఎలుకలను 129/REJ;C57BL6 మిశ్రమ నేపథ్యంలో ఉంచారు.జెనెటిక్ ట్రాప్ వెక్టర్ యొక్క చొప్పించే ప్రదేశం యొక్క స్థానం RT-PCR, జీనోమ్ సీక్వెన్సింగ్ మరియు జెనెటిక్ కాంప్లిమెంటేషన్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1) ద్వారా నిర్ధారించబడింది.డబుల్ హెటెరోజైగస్ Specc1lGT ఎలుకల CNCC వంశాన్ని గుర్తించడానికి, ROSAmTmG (#007576) మరియు Wnt1-Cre (#003829) ఎలుకలు (జాక్సన్ ల్యాబొరేటరీ, బార్ హార్బర్, ME) ROSAmTmG మరియు Wnt1-Cre all mut.యూనివర్శిటీ ఆఫ్ కాన్సాస్ మెడికల్ సెంటర్ యొక్క ఇనిస్టిట్యూషనల్ యానిమల్ కేర్ అండ్ యూజ్ కమిటీ ఆమోదించిన ప్రోటోకాల్స్ ప్రకారం ఎలుకలలో అన్ని ప్రయోగాలు జరిగాయి.
పిండాలను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 60 నిమిషాల పాటు (1% ఫార్మాల్డిహైడ్, 0.2% గ్లూటరాల్డిహైడ్, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) స్థిరపరచారు.X-gal స్టెయినింగ్ ద్రావణంలో స్థిరీకరణ తర్వాత (5 mM పొటాషియం ఫెర్రికనైడ్, 5 mM పొటాషియం ఫెర్రోసైనైడ్, 2 mM MgCl2, 0.01% సోడియం డియోక్సికోలేట్, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) 37 ° C వద్ద మరక అభివృద్ధి జరిగింది. .1-6 గంటల్లో °C.పిండాలు 4% PFAలో పోస్ట్-ఫిక్స్ చేయబడ్డాయి మరియు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.
పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ కోసం, కణాలు HALT ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్స్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO) మిశ్రమంతో అనుబంధంగా నిష్క్రియ లైసిస్ బఫర్ (ప్రోమెగా, ఫిచ్‌బర్గ్, WI)లో లైస్ చేయబడ్డాయి.లైసేట్‌లు 12% పాలియాక్రిలమైడ్ మినీ-ప్రోటీన్ TGX రెడీమేడ్ జెల్‌లపై (బయో-రాడ్, హెర్క్యులస్, CA) ప్రాసెస్ చేయబడ్డాయి మరియు ఇమ్మోబిలాన్ PVDF పొరలకు (EMD మిల్లిపోర్, బిల్లెరికా, MA) బదిలీ చేయబడ్డాయి.0.1% మధ్య ఉన్న PBSలో 5% పాలలో పొరలు నిరోధించబడ్డాయి.ప్రతిరోధకాలు రాత్రిపూట 4 ° C వద్ద లేదా గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఒక గంట పాటు పొదిగేవి.ఫెమ్టో సూపర్ సిగ్నల్ వెస్ట్ ECL రియాజెంట్ (థర్మో సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, MA) సిగ్నల్ ఉత్పత్తి కోసం ఉపయోగించబడింది.ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కోసం, పిండాలు 4% PFA/PBSలో రాత్రిపూట స్థిరపరచబడ్డాయి మరియు క్రయోప్రెజర్డ్ చేయబడ్డాయి.1% సాధారణ మేక సీరం (థర్మో సైంటిఫిక్, వాల్తామ్, MA) మరియు 0.1% ట్రిటాన్ X-100 (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్ లూయిస్, MO) కలిగిన PBSలో కణజాల క్రయోసెక్షన్‌లు నిరోధించబడ్డాయి మరియు ఆ సమయంలో ఇంక్యుబేటర్‌లో 4°C వద్ద పొదిగేవి. రాత్రి.యాంటీ-యాంటీబాడీ మరియు ఫ్లోరోసెంట్ సెకండరీ యాంటీబాడీ (1:1000)తో 1 గంట 4°C వద్ద.స్టెయిన్డ్ విభాగాలు ప్రోలాంగ్ గోల్డ్ మీడియం (థర్మో సైంటిఫిక్, వాల్తామ్ MA)లో ఉంచబడ్డాయి మరియు లైకా TCS SPE కన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోప్ ఉపయోగించి ఫ్లాట్ ఇమేజ్‌లు పొందబడ్డాయి.ప్రతి ఇమ్యునోస్టెయినింగ్ కనీసం రెండు ఉత్పరివర్తన పిండాల సిరోసెక్షన్‌లపై మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాలుగా నిర్వహించబడింది.ప్రతినిధి ప్రయోగం చూపబడింది.
కణాలు సవరించిన RIPA బఫర్‌లో పొదిగేవి (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% గ్లిసరాల్, 2 mM EDTA, మరియు HALT ప్రోటీజ్ ఇన్హిబిటర్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్, సెయింట్. లూయిస్) క్లుప్తంగా, లైసేట్‌లను ప్రోటీన్ G మాగ్నెటిక్ పూసలతో (లైఫ్ టెక్నాలజీస్, కార్ల్స్‌బాడ్, CA) ముందుగా శుద్ధి చేసి, ఆపై SPECC1L వ్యతిరేక లేదా IgG ప్రోటీన్ G ప్రోటీన్ పూసలతో 4 ° C వద్ద రాత్రిపూట పొదిగేవి మరియు SPECC1Lని సంగ్రహించడానికి ఉపయోగించబడ్డాయి మరియు పాశ్చాత్య బ్లాటింగ్ చేయడం జరిగింది. పైన వివరించిన -β-కాటెనిన్ యాంటీబాడీ చూపిన సహ-IP ప్రయోగాలు నాలుగు స్వతంత్ర ప్రయోగాలకు ప్రతినిధి.
యూనివర్శిటీ ఆఫ్ కాన్సాస్ మెడికల్ సెంటర్‌లోని ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ సెంటర్‌కు స్థిర కల్చర్డ్ కణాలు లేదా మౌస్ పిండ కణజాలాలు అందించబడ్డాయి.క్లుప్తంగా, నమూనాలు EMbed 812 రెసిన్ (ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ సైన్సెస్, ఫోర్ట్ వాషింగ్టన్, PA)లో పొందుపరచబడ్డాయి, రాత్రిపూట 60 ° C వద్ద పాలిమరైజ్ చేయబడ్డాయి మరియు డైమండ్ బ్లేడ్‌తో కూడిన లైకా UC7 అల్ట్రామైక్రోటోమ్‌ను ఉపయోగించి 80 nm వద్ద విభజించబడ్డాయి.100 kV Lab6 గన్‌తో కూడిన JEOL JEM-1400 ట్రాన్స్‌మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోప్‌ని ఉపయోగించి విభాగాలు దృశ్యమానం చేయబడ్డాయి.
ఈ కథనాన్ని ఎలా ఉదహరించాలి: విల్సన్, NR మరియు ఇతరులు.SPECC1L యొక్క లోపం స్ప్లిస్డ్ జాయింట్స్ యొక్క స్థిరత్వాన్ని పెంచుతుంది మరియు కపాల నాడీ క్రెస్ట్ కణాల డీలామినేషన్ తగ్గుతుంది.శాస్త్రం.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
సెయింట్-జీన్, J.-P.న్యూరల్ క్రెస్ట్ యొక్క ఇండక్షన్ మరియు భేదం.(స్ప్రింగర్ సైన్స్ + బిజినెస్ మీడియా; లాండెస్ బయోసైన్స్/Eurekah.com, 2006).
కోర్డెరో, ​​DR మరియు ఇతరులు.కదలికలో కపాల నాడీ క్రెస్ట్ కణాలు: క్రానియోఫేషియల్ అభివృద్ధిలో వాటి పాత్ర.అమెరికన్ జర్నల్ ఆఫ్ మెడికల్ జెనెటిక్స్.పార్ట్ A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
బోలాండ్, RP న్యూరోక్రిస్టోపతియా: 20 సంవత్సరాలలో దాని పెరుగుదల మరియు అభివృద్ధి.పిల్లల వైద్యుడు.పాథాలజీ.ప్రయోగశాల.మందు.17, 1–25 (1997).
మాంగోల్డ్ E., లుడ్విగ్ KU మరియు నోటెన్ MM ఒరోఫేషియల్ క్లెఫ్ట్స్ జన్యుశాస్త్రంలో పురోగతి.మాలిక్యులర్ మెడిసిన్ ట్రెండ్స్ 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
మిను, M. మరియు రిలే, క్రానియోఫేషియల్ అభివృద్ధి సమయంలో కపాల నాడీ క్రెస్ట్ సెల్ మైగ్రేషన్ మరియు నమూనా యొక్క FM మాలిక్యులర్ మెకానిజమ్స్.అభివృద్ధి 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
డిక్సన్, MJ, మరాజిటా, ML, బీటీ, TH మరియు ముర్రే, JK క్లెఫ్ట్ పెదవి మరియు అంగిలి: జన్యు మరియు పర్యావరణ ప్రభావాలను అర్థం చేసుకోవడం.సహజ వ్యాఖ్య.జన్యుశాస్త్రం 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
ఇంగ్రామ్, CR మరియు ఇతరులు.ఇంటర్ఫెరాన్-రెగ్యులేటింగ్ ఫ్యాక్టర్-6 (Irf6)-లోపం ఉన్న ఎలుకలలో చర్మం, అవయవాలు మరియు క్రానియోఫేషియల్ ప్రాంతం యొక్క అసాధారణ స్వరూపం.నేషనల్ జెనెట్.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
పెరార్డ్-జాన్విద్, M. మరియు ఇతరులు.GRHL3లోని ఆధిపత్య ఉత్పరివర్తనలు వాన్ డెర్ వార్డ్ సిండ్రోమ్‌కు కారణమవుతాయి మరియు నోటి పెరిడెర్మ్ అభివృద్ధిని బలహీనపరుస్తాయి.ఆమ్ J హమ్ జెనెట్ 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
హారిస్, MJ మరియు జురిలోఫ్, DM న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేతలో లోపాలతో మౌస్ మార్పుచెందగలవారి జాబితాను అప్‌డేట్ చేసి, న్యూరల్ ట్యూబ్ మూసివేతపై పూర్తి జన్యుపరమైన అవగాహన దిశగా ముందుకు సాగారు.పుట్టుకతో వచ్చే లోపాల పరిశోధన.పార్ట్ A, క్లినికల్ అండ్ మాలిక్యులర్ టెరాటాలజీ 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-మధ్యవర్తిత్వ PDGFRalpha సిగ్నలింగ్ p53-ఆధారిత కణాంతర మార్గం ద్వారా అస్థిపంజర అభివృద్ధిలో మనుగడ మరియు విస్తరణను నియంత్రిస్తుంది.జన్యు అభివృద్ధి 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
కోప్, AJ, గ్రీన్, ND మరియు మర్డోక్, JN డిషెవెల్డ్: న్యూరల్ ట్యూబ్ క్లోజర్‌కు కన్వర్జెంట్ ఎక్స్‌పాన్షన్‌కి సంబంధించిన సంబంధం.న్యూరాలజీలో పోకడలు.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).